红曲米培养工艺的优化研究

罗 莉，黄启林，谭爱华，李方桥，孙 智

(1.湖北三峡职业技术学院农学院，湖北宜昌 443003；2.宜昌市裕禾菌业有限公司，湖北宜昌 443003)

红曲霉是中国传统食品发酵中重要的微生物，尤其是在传统发酵领域和食品配料领域有着非常广泛的应用。首先红曲霉可以产生诸如糖化酶、酯化酶、蛋白酶等酶制剂，因此可以被应用于酿造、蛋白制品发酵等领域，作为原料降解、风味物质合成等多用途[1-2]。另外红曲霉的两大类次级代谢产物也被广泛的应用，红曲色素是目前使用历史最长、应用体量最大、使用范围最为广泛的一类红曲霉代谢产物，其应用已有上千年历史，独特的天然色素属性一直受到食品行业青睐[3]。另一大类红曲霉次级代谢产物是近几年研究比较多的健康功能因子，如具有降血脂功能的莫纳克林K 以及具有调节身体功能的γ-氨基丁酸类[4-5]。红曲霉健康功能因子在亚洲有较早的认知和应用历史，近些年也正逐步被欧美国家接受[6]。

目前国内和红曲相关的国家标准共有4 个[7]，其中真正和红曲霉相关的为GB 1886.19—2015《食品添加剂红曲米》，其他都与红曲色素相关。作为红曲米生产单位，在国标限制范围内，红曲霉只能采用大米作为培养原料，所以红曲霉的培养至关重要[8]。本研究以工业红曲米生产为背景，探索色素型红曲霉工业生产碳源、氮源，优化培养工艺，以期为红曲霉的工业化生产原材料选择做一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

菌种：红曲霉Q，实验室菌种。

原材料：葡萄糖、籼米、黄豆饼粉、玉米粉、玉米淀粉、米粉均采购自宜昌当地农贸市场。

试剂及耗材：酵母浸出物FN502，安琪酵母股份有限公司；琼脂粉，硫酸镁，磷酸二氢钾，硝酸钠，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 培养基

菌种斜面培养基（加强型PDA 培养基）：PDA培养基（g/L）：去皮马铃薯200，葡萄糖18，硫酸镁5，磷酸二氢钾5，琼脂粉20。

液体种培养基（g/L）：碳源30（葡萄糖、蔗糖、淀粉、米粉、玉米粉、固态麦精）、氮源3（酵母浸出物、硝酸钠、蛋白胨、黄豆粉、硫酸铵、氯化铵）、磷酸二氢钾0.5、硫酸镁0.5。

1.1.3 仪器设备

ZXMP-A1430 恒温恒湿培养箱；BSC-1300ⅡB2 无菌操作台UV5200 分光光度计；ZQZY-85CN恒温摇床。

1.2 实验方法

1.2.1 试验工艺

本试验采用工艺流程：斜面菌株→茄子瓶（孢子悬浊液）→液体一级种→米饭（接种）→浅盘→翻料→培养

1.2.2 孢子悬浊液制备

茄子瓶中，采用红曲霉菌种斜面培养基制备，划线接种。在33 ℃条件下培养5～7 d，后采用60 mL无菌水洗脱，备用。

1.2.3 一级种子制备

将1.2.2 中的孢子悬浊液按照培养体积的3 %进行添加，在摇床200 r/min，33 ℃条件下，培养48 h后检测色价并备用。

在碳源考察中，氮源采用酵母浸出物，当完成碳源考察后，固定效果最佳碳源，考察氮源。

1.2.4 培养及检测

将籼米浸泡12 h 后，沥干水分，上汽蒸30 min后，摊晾。将培养好的种子液用无菌酸化水pH3.5稀释5 倍，分别按照15%接种米饭搅拌均匀，33 ℃培养，每天观察水分含量进行翻料补水，米饭维持水分40%～45%，培养10 d 后，50 ℃慢速干燥、粉碎80～100 目、检测色价。检测方法参照GB 1886.19—2015《食品安全国家标准食品添加剂红曲米》进行。

2 结果与分析

2.1 不同碳源的种子液色价发酵结果

在不同碳源条件下，种子液发酵48 h 后色价出现了显著的变化，如图1 所示，在几种碳源条件下，发现单糖和二糖类在其中对红曲霉色素的代谢没有显著促进作用，另外还有一个明显的差异，就是在淀粉上面，玉米淀粉与米粉都显示出了非常好的效果，在这点上何冬萍等[9]采用葛根粉在液态红曲霉培养中，发现葛根粉与米粉的差异不大，说明此类淀粉都可以很好的促进红曲霉色素代谢积累。整体效果上，玉米粉与玉米淀粉的差异，我们认为主要在颗粒度上有差异，导致实际培养体系中菌体接触面以及溶解性都会影响到红曲霉后续的产色素能力。鉴于玉米淀粉与米粉效果接近，考虑到工业实际生产应用成本因素，后续对氮源的考察采用玉米淀粉作为固定碳源。

图1 不同碳源条件下发酵48 h色价变化

2.2 不同氮源的种子液色价发酵结果

图2 的结果是在以玉米淀粉为碳源条件下，对氮源进行了考察，为了避免上面的影响，我们将碳源减少为之前比例的30 %进行实验，发现有如下特点。在碳源减少条件下，酵母浸出物在发酵过程中对色素的积累的影响是最低的，而无机氮，尤其是硝酸氮的表现是最佳的。这点与相关研究是吻合的[10]，无机氮在红曲霉色素积累方面更有优势，另外，在一些文献报道里面，铵盐在生物量上有一定的优势，在本次研究中，没有以生物量作为核心指标，而是将色价作为评价指标，本次研究中显示硝酸钠对于红曲霉色素的积累有促进作用。

图2 不同氮源条件下发酵48 h色价变化

2.3 碳源氮源配比研究

在上面两个实验的基础上，由于3%的碳源已显示出比较好的效果，后面我们固定碳源水平，对硝酸钠的添加量做了梯度添加，并将培养好的种子液接入米饭中培养，结果如图3所示。

图3 不同碳氮比下的种子培养色价和终产品色价

最终的结果可以清晰的显示，在碳源固定后，加入硝酸钠的量对于种子的色素积累同样有一定的影响。结果表明，如果种子液的色价情况好，最终红曲米的色价积累情况也好，在本次实验中，种子液色价和最终红曲米的色价有一定正相关性，且硝酸钠的最佳添加范围在培养基的0.2%～0.4%。

3 结论

红曲霉（红曲米）的生产需要从效率以及成本多方面考虑，本文从实际应用角度出发，发现玉米淀粉与硝酸钠均有较好的红曲霉色素积累功效，在红曲霉生长过程中，二者的添加对于红曲霉的色素积累有一定的叠加作用，另外从另一个角度发现，种子液的色价与最终产品色价有一定的正相关性。结果显示，当最终种子液采用3%玉米淀粉与0.2 %～0.4 %的硝酸钠时，种子液的色价积累较好，且在最终红曲米的接种和最终生产结果上，可以达到产品质量要求。

中国是世界上红曲霉相关产品最大的生产国和消费国，而红曲米的生产目前整体条件参差不齐[11]，与现有工业微生物生产模式相比，红曲米的生产还存在单批产量小、微生物控制难度大、产品质量波动大的问题，在现有条件下，进一步提升红曲霉类产品的生产工艺及其配套条件是行业需要共同关注的问题。除了基础食品工业外，红曲霉的功能特性已经成为近些年的研究热点，为红曲霉工业的进一步提升创造了很好的条件。