在线净化液相色谱串联质谱法测定茶叶中11种磺胺类抗生素

罗漪涟 王雨晴 朱佳明 唐媛媛

磺胺类抗生素属于广谱抗菌药物，具有价格低廉、疗效显著等特点，广泛用于畜牧水产养殖行业。抗生素经人体或动物摄入后，大部分以原形或代谢产物的形式排放进入环境，对生态系统和人类健康造成威胁。茶叶在种植过程中通常会施用有机肥，可能存在磺胺类抗生素残留的风险。目前，对于环境中抗生素的检测方法相对成熟，而茶叶中抗生素的检测方法较少。

本文采用在线净化液相色谱串联质谱法，对茶叶中11种磺胺类抗生素进行了研究分析，建立了在线净化液相色谱串联质谱法测定茶叶中11种磺胺类抗生素的方法。样品经提取液（乙腈︰0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液）提取、在线净化柱Cyclone-P净化、Hypersil Gold色谱柱分离，用液相色谱串联质谱检测。结果表明，11种磺胺类抗生素在茶叶中的回收率为79.7%-116.6%，相对标准偏差RSD为2.37%-13.4%，并且在10-500μg/kg浓度范围内有良好的线性关系。本检测方法简便快捷，灵敏度高，定性定量结果准确可靠，为茶叶质量安全提供了技术保障。

一、仪器与试剂

1.仪器。TurboFlow在线净化液相色谱串联质谱仪，美国ThermoFisher公司，包括CTC多功能自动进样器、2个四元梯度液相泵、六通阀切换装置、多元柱切换装置和TSQ Quantum Ultra三重四级杆液质联用仪;漩涡混合器，美国Talboys公司;KS 4000i振荡器，德国IKA公司;5804R冷冻离心机，德国Eppendorf公司;纯水仪，美国Millipore公司。

2.试剂。甲醇和乙腈为质谱纯，甲酸为色谱纯，一水合柠檬酸、十二水合磷酸氢二钠、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠均为分析纯，实验用水为超纯水。

0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液：将12.9g一水合柠檬酸和27.58g十二水合磷酸氢二钠溶于1L水中，完全溶解后加入37.2g乙二胺四乙酸二钠，超声至全溶，用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.0±0.5。

3.材料。磺胺类标准品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺异恶唑，天津阿尔塔科技有限公司;磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺间二甲氧嘧啶，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

以甲醇为溶剂，将上述磺胺类标准品配制成浓度为100mg/L或10mg/L的标准储备液，在-20℃条件下储存。再用甲醇将标准储备液逐级稀释成适当浓度的标准混合工作液，为后续实验做准备。

二、实验与方法

1.样品前处理。准确称取2.00g茶叶样品于50mL塑料离心管中，加入V（乙腈）：V（0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液）为1︰1的提取液16mL，于漩涡混合器上涡旋1min，振荡20min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22μm滤膜，上机测定。

2.分析条件。（1）在线净化条件。在线净化环節在四元泵Loading泵作用下进行，主要包括目标物的净化和富集。在线净化柱：Cyclone-P柱（0.5mm×50mm）;流动相A为甲酸水溶液（0.4%），B为乙腈，C为乙腈-异丙醇-丙酮（体积比为45︰45︰10）;进样体积：50μL。

（2）液相色谱条件。液相梯度洗脱环节在四元泵Eluting泵作用下进行，使净化后的目标物在分析柱上进行洗脱分离并在质谱中分析。色谱柱：Hypersil GOLD柱（100mm×2.1mm，3μm）;流动相A为甲酸水溶液（0.4%），B为乙腈。在线净化和梯度洗脱程序详见表1。

（3）质谱条件。电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，多反应监测（MRM），电喷雾电压：3500V，离子源温度：300℃，鞘气压力：40Arb，辅助气压力：10Arb，毛细管温度：350℃。11种化合物的质谱参数详见表2。

三、结果与讨论

1.提取条件优化。分别对比提取液为纯乙腈、不同体积比的乙腈和0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液的提取效率，结果表明，当乙腈和0.1mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液的体积比为1︰1时，提取效率高，故以此作为实验的提取液。因为茶叶样品制备后，相对土壤样品需要体积较多的提取液才能保证充分提取，所以提取液体积适当增加至16mL。

2.在线净化和液相条件优化。在线净化过程中，对比使用甲酸水溶液（0.4%）、甲酸水溶液（0.1%）和乙酸铵溶液（10mmol/L）作为上样流动相A，磺胺类化合物都能有效保留，相比之下在甲酸水溶液（0.4%）条件下，目标分析物的峰形和响应更好，故选其作为上样流动相A。为了简化实验程序，在液相梯度洗脱过程中，仍选用甲酸水溶液（0.4%）作为流动相A，发现目标分析物能够有效地被洗脱分离进质谱中，且保留时间、峰形和响应值均满足要求。

3.线性范围。在空白茶叶样品中分别加入适量混合标准溶液，使其浓度分别为10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、500μg/kg，按照上述实验方法进行检测，以目标分析物的峰面积和浓度作图，得出11种化合物的线性方程和相关系数，详见表3。结果表明，11种磺胺类药物在10-500μg/kg的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r均大于0.99。

4.回收率和精密度。在空白茶叶样品中分别添加不同量的混合标准溶液，使11种磺胺类药物的浓度分别为50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg，每个浓度均有6个平行样，按照上述实验方法测定各自的回收率和精密度。结果表明，茶叶中11种磺胺类药物的回收率在79.7%-116.6%，相对标准偏差RSD在2.37%-13.4%，满足残留分析的要求，详见表3。

本文建立了在线净化液相色谱串联质谱测定茶叶中11种磺胺类抗生素的方法，实现了样品前处理的在线自动化操作，节省了时间、人力和消耗品成本，有效降低了基质效应，提高了检测灵敏度，从而得到准确可靠的定性定量结果。

作者简介：罗漪涟，农艺师，从事农产品质量安全检测工作。