基于TLR4/NF-κB通路研究益气活血药对心梗大鼠心室功能的影响

冯鹏飞 郭书文 魏路路 王惠 刘云柯 魏梵域

心肌梗死(myocardial infarction,MI)是严重的心血管疾病，病死率较高，根据《中国心血管病报告 2018》显示，中国心血管病患病率持续上升、心血管病死亡率仍居首位[1]，其中MI是重要致死因素。心肌梗死后心力衰竭是常见且严重的合并症，其发生发展与心室重塑、炎症反应等因素有关[2]。Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)介导TLR4/NF-κB信号通路，通过调节心肌细胞氧化应激和凋亡[3]、心肌纤维化[4]及炎症反应[5]等参与心肌梗死相关的病理进程，与MI后心室功能的进展密切相关。课题组前期研究发现益气活血药对MI后心室功能具有保护作用，本研究将着重探讨这种保护作用的发挥是否与TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应相关及其对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白细胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)表达的影响，为益气活血药防止MI后心室功能进展障碍的机制研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用50只健康的雄性SD(Sprague Dawley)大鼠，SPF级，8周龄，体质量(200±20) g，从北京维通利华实验动物技术有限公司购买，生产许可证编号：SCXK(京)2016-0006。动物饲养于北京中医药大学动物实验中心。

1.2 药物和器材

1.2.1 药物制备 益气活血药由生黄芪30 g、生晒参10 g、当归15 g、三七6 g、川芎15 g组成，该药物已申请专利(专利申请号为 201610368030.7)。中药材从北京中医药大学东直门医院中药房购入，根据口服水煎剂进行制备，浸泡、煎煮、滤过、回流提取后浓缩定容，调整药物浓度到每毫升药液含生药0.82 g；阳性对照药物培哚普利(雅施达)，施维雅天津制药有限公司，国药准字：H20034053，研磨后利用蒸馏水制备成溶液使用。

1.2.2 主要试剂和仪器 TLR4(Proteintech，货号：19811-1-AP)、NF-κB(Abcam，货号：Ab16502)；大鼠TNF-α(武汉华美，货号：CSB-E11987r，96T)、大鼠MCP-1(武汉华美，货号：CSB-E07429r，96T)、大鼠IL-6(武汉华美，货号：CSB-E04640r，96T)检测试剂盒；小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司，ALC-V8)，全景扫描仪(3DHISTECH公司，Pannoramic MIDI)，高分辨率小动物超声系统(加拿大VisualSonics公司，Vevo770)，电泳仪(Bio-Rad公司，Mi-PROTEAN Tetra)等。

1.3 实验造模

适应性喂养3天后，对实验动物进行称重，选择体质量(200±20) g的35只大鼠进行造模。大鼠心肌梗死模型的制备采用结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending，LAD)的方法进行[6]。麻醉用药选择1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)、麻醉方式为腹腔注射；麻醉后对手术区进行备皮、消毒，并进行气管插管；逐层剪开3～4 肋间皮肤并消毒，为避免出血，肌层采取钝性分离；经气管插管连接小动物呼吸机，钝性分离3、4肋间肌肉开放胸腔，将心脏从心包膜中暴漏，使用 5/0 无菌带线缝合针在左心耳与肺动脉圆锥间下2 mm 处结扎LAD及其伴行血管；结扎后心脏迅速复位，清理出血及排空气体后闭合胸腔，逐层消毒并缝合，待大鼠恢复自主呼吸后拔掉气管插管。假手术与造模手术操作大致相同，但假手术只进行穿线而不进行结扎。为防止感染，术后青霉素钠预防用药，每只 20 万单位/天，连续用药3天。对35只大鼠进行造模手术，术中术后死亡6只，24只大鼠造模成功。10只进行假手术，术中死亡2只。

1.4 实验分组及给药

术后第二天，对存活大鼠行心电图检查，观察并计数大鼠心电图Ⅰ导联、aVL导联及V1-V6导联中的病理性Q波，病理性Q波计数在5个以上视为造模成功[7]。获得24只心梗大鼠进行随机分配，将其分别分配到模型组、培哚普利组及益气活血组，每组8只。并利用8只假手术大鼠作为对照组。术后第二天进行给药，连续灌胃给药28天。给药剂量按照临床等效剂量进行换算，其中益气活血组每天给药8.2 g/(kg·d)、培哚普利组每天给药剂量0.4 mg/(kg·d)。假手术组和模型组每天给予等量蒸馏水灌胃。

1.5 指标检测

1.5.1 超声心动检测大鼠左室功能 给药28天后，对各组大鼠左心室功能进行超声心动检测，观察药物对左室功能的影响。检测时利用高频探头RMV716进行定位，通过M模式对心室功能分析评价，采集3个连续的心动周期取平均值。主要检测指标包括左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)、左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole，LVIDs)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短轴率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.5.2 大鼠血液和心肌组织取材 超声结束后，对大鼠进行腹主动脉取血，然后进行心脏组织取材。血液样本4℃状态下自然沉淀凝固30分钟，3000 r/min离心15分钟，取上清-80℃保存用于酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)；心肌组织一部分4%多聚甲醛溶液固定处理后用于石蜡包埋切片，其余部分分离梗死边缘区，-80℃保存用于蛋白免疫印迹检测(Western Blot，WB)。

1.5.3 苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色) 4%多聚甲醛固定心肌组织，进行包埋切片并进行HE染色，全景扫描显微镜下观察病理切片并采集图像。

1.5.4 WB检测TLR4、NF-κB蛋白表达 取梗死边缘区组织50 mg在RIPA裂解液中充分裂解、匀浆，4℃离心取上清后采用BCA法进行蛋白定量，SDS-PAGE蛋白质电泳，PVDF转膜，室温封闭及一抗二抗孵育后曝光，最后对胶片进行扫描后Quantity One图像分析软件对蛋白条带进行光密度值分析，β-actin作为内参。TLR4、NF-κB的相对表达量利用TLR4、NF-κB条带与β-actin的光密度值的比值表示。观察给药28天后各组心梗大鼠梗死边缘区心肌组织中TLR4、NF-κB蛋白的表达及药物影响。

1.5.5 ELISA检测TNF-α、MCP-1、IL-6含量 ELISA法测定血清TNF-α、MCP-1、IL-6的变化，依据试剂盒说明进行操作。观察给药28天后各组心梗大鼠血清中炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-6含量变化及药物影响。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠左室功能比较

给药28天后，超声心动图检测各组大鼠左室功能。模型组较假手术组：LVIDd、LVIDs均显著升高(P<0.05)，LVEF、LVFS均显著降低(P<0.05)；给药组较模型组：LVIDs显著性降低(P<0.05)、LVEF、LVFS均显著性升高(P<0.05)、LVIDd无明显变化；益气活血组与培哚普利组比较： LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS，各指标变化均无统计学差异。见表1。

表1 给药28天后各组心梗大鼠左心室功能变化

2.2 各组大鼠梗死边缘区心肌组织HE染色结果

给药28天后，梗死边缘区HE染色发现：假手术组心肌纤维排列规整，结构清晰，细胞形态无明显改变，少见炎性细胞侵润；模型组心肌纤维排列散乱，结构模糊，细胞形态明显改变、呈现不规则形状，间隙明显增宽，细胞核游移散乱，细胞间质出现大量炎性细胞浸润；培哚普利组和益气活血组心肌纤维排列较为规整，结构清晰，细胞形态较为规则，细胞间隙稍有增宽，可见部分炎性细胞浸润。见图1。

注：A:假手术组；B:模型组；C:培哚普利组；D:益气活血药组

2.3 各组大鼠梗死边缘区心肌组织中TLR4、NF-κB蛋白的表达情况

给药28天后，检测各组梗死边缘区心肌组织中TLR4、NF-κB蛋白的表达情况，结果显示：模型组中TLR4、NF-κB蛋白表达较假手术组显著性升高(P<0.05)；培哚普利组和益气活血组中TLR4、NF-κB蛋白表达较模型组显著性降低(P<0.05)；给药组组间，TLR4、NF-κB蛋白表达情况无统计学差异。见表2，图2。

表2 各组大鼠梗死边缘区TLR4、NF-κB蛋白表达结果

注：A:假手术组; B:模型组; C:培哚普利组; D:益气活血药组

2.4 各组大鼠血清炎症因子含量变化

给药28天后，检测各组大鼠血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量，结果显示：模型组血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量较假手术组显著性升高(P<0.05)；培哚普利组和益气活血药组血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量较模型组显著性降低(P<0.05)；在用药组间，血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量变化无统计学差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清TNF-α、MCP-1及IL-6含量变化

3 讨论

中医认为心主血脉，脉为血府，以气为本。MI在中医上属于“胸痹”“真心痛”范畴，病机多属“本虚标实”，阳虚、气虚为本，血瘀为标[8]。针对气虚血瘀的病机，临床上多采用益气活血的组方进行治疗。本研究中益气活血药以黄芪、当归、生晒参、川芎、三七等药进行配伍组方，发挥益气活血、通补兼施的功效，对MI气虚血瘀证具有重要的应用价值。前期研究发现，益气活血药通过调节MI后心室重构、心肌纤维化及心肌细胞凋亡[9-11]对心室功能发挥保护作用。

TLR4/NF-κB信号通路介导的慢性炎症反应在多种疾病的进程中起到重要的调节作用。作为经典的炎症调节通路，在MI的相关研究中，TLR4/NF-κB通过调节炎症因子的表达介导心肌炎症损伤和心肌重塑，这些炎症因子包括TNF-α、MCP-1及IL-6等[12-14]。在对MI后心力衰竭的相关研究中发现通过抑制TLR4/NF-κB信号通路介导的炎症反应，能够改善心肌缺血后心室功能的进展性障碍，降低心力衰竭的风险[15-16]。Yang等[17]利用分离出的紫草素作用心脏损伤模型，发现其通过抑制胶原聚集、TLR4/NF-κB等途径，显著改善心肌损伤后的心功能，减少心肌纤维化、抑制炎症、减轻细胞凋亡和内质网应激，缓解体内心力衰竭。HU等[18]通过敲除小鼠TLR4基因研究高脂饮食所致的心功能不全，发现炎症反应在其中起重要作用，TLR4基因敲除可能通过NF-κB/JNK调节自噬，抑制炎症和活性氧自由基，改善心肌收缩功能和Ca2+异常，减轻心肌重塑和收缩功能障碍的发生和发展。

本研究基于TLR4/NF-κB信号通路，从炎症反应的角度出发，研究益气活血药对MI后心室功能的调节作用。研究结果表明，益气活血药能够显著改善心梗大鼠左室功能，抑制TLR4、NF-κB蛋白在梗死边缘区心肌组织中的表达，降低心梗大鼠血清组织中TNF-α、MCP-1、IL-6等炎症因子的含量，减轻心梗大鼠MI后持续的炎症反应。提示益气活血药可能通过TLR4/NF-κB信号通路，抑制心梗大鼠的炎症反应，阻止心室功能的进展性障碍，从而发挥保护心梗大鼠心室功能的作用。

综上所述，心室功能的进展性障碍作为影响MI预后的重要因素，研究其病理基础和药物对其进行防治的作用机制具有重要意义。益气活血药在阻止MI后心室功能的进展性障碍方面能够发挥重要的作用，TLR4/NF-κB信号通路作为潜在的作用途径，可能通过抑制慢性炎症反应保护心脏功能。