E1A激活基因阻遏子基因对血管紧张素Ⅱ刺激后小鼠原代心肌细胞凋亡影响

刘 丹， 宋海旭， 闫承慧， 刘艳霞

北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016

心血管疾病严重威胁着人类健康，心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段[1-5]，心肌细胞凋亡、氧化应激障碍、免疫炎症反应和线粒体损伤等多种因素共同参与心力衰竭的发生发展[6-9]，但其关键发病机制尚不十分清楚。因此，阐明心力衰竭的发生机制、寻找到新的干预靶点，将成为心血管领域亟需解决的问题。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)是一种重要的心肌保护因子[10-15]。在小鼠心肌缺血再灌注损伤后，心肌组织中CREG蛋白表达明显下降，外源性给予CREG重组蛋白后可通过影响心肌细胞自噬和凋亡显著改善小鼠心肌缺血再灌注损伤[10]。在CREG表达缺失的杂合子小鼠中，给予血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)刺激后，心肌纤维化明显加重，心肌细胞自噬功能障碍[15]。然而，CREG对AngⅡ刺激后心肌细胞凋亡的影响目前尚不清楚。本研究旨在探讨CREG对AngⅡ刺激后心肌细胞凋亡的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 CREG抗体(Abcam公司，英国)，Cleaved-caspase3抗体(剪切型的半胱天冬酶，Cell signaling technology公司，美国)，Bax抗体(Cell signaling technology公司，美国)，Bcl-2抗体(Cell signaling technology公司，美国)，β-actin抗体(北京博奥森生物技术有限公司，中国)，HRP标记的二抗(Jackson ImmunoResearch，美国)，AngⅡ(大连美仑生物技术有限公司，中国)，逆转录试剂盒(TAKARA公司，日本)。

1.2 小鼠原代心肌细胞提取及培养 使用胶原酶和胰酶提取出生1～3 d的小鼠乳鼠原代心肌细胞，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。待细胞密度达70%左右时，将细胞分为对照组与AngⅡ组(1μM，刺激24 h)。此外，将CREG过表达的腺病毒(adCREG)及其对照病毒(adcon)加入到细胞上清后再给予AngⅡ刺激，24 h后收集细胞提取蛋白。

1.3 荧光定量PCR检测CREG基因表达 采用Trizol方法提取细胞总RNA后进行逆转录反应。采用下列引物定量PCR反应，CREG正向引物：CTTCGCGGACATCATCTCAAT,CREG反向引物：GTCAGCGTAGCCTCTGGATTT；GAPDH正向引物：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG，GAPDH反向引物：GGGGTCGTTGATGGCAACA。

1.4 Western blot检测细胞凋亡 采用蛋白裂解RIPA裂解液进行细胞总蛋白提取，BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE胶对细胞总蛋白进行电泳。一抗采用抗CREG、Cleaved-caspase3抗体、Bax抗体和Bcl-2抗体；二抗使用HRP标记的抗体，内参基因为β-actin。使用Image-Pro Plus 6.0软件对条带进行灰度分析。

2 结果

2.1 AngⅡ刺激后心肌细胞中CREG蛋白表达情况 对照组与AngⅡ组的CREG基因mRNA表达情况比较，差异无统计学意义(P>0.05，图1a)；但AngⅡ组CREG蛋白水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01，图1b、c)；提示CREG表达下降可能与AngⅡ引起的心肌细胞损伤存在相关性。

图1 AngⅡ刺激小鼠原代心肌细胞后CREG基因mRNA和蛋白表达检测(a.定量PCR检测对照组和AngⅡ组小鼠原代心肌细胞CREG基因mRNA表达；b、c.Western blot检测对照组和AngⅡ组小鼠原代心肌细胞CREG蛋白表达)

2.2 构建CREG过表达的小鼠原代心肌细胞 adCREG组CREG基因mRNA和蛋白表达水平均明显高于adcon组，差异有统计学意义(P<0.01，图2)，提示CREG过表达的心肌细胞建立成功。

图2 构建CREG过表达的小鼠原代心肌细胞(a.定量PCR检测adcon组和adCREG组CREG基因mRNA表达；b、c.Western blot检测adcon组和adCREG组CREG蛋白表达)

2.3 CREG过表达对AngⅡ刺激后小鼠原代心肌细胞凋亡的影响 adCREG组CREG蛋白表达明显高于adcon组，差异有统计学意义(P<0.01)；但两组Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。adcon+AngⅡ组CREG和Bcl-2蛋白表达明显低于adcon组，而Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达明显高于adcon组，差异均有统计学意义(P<0.01)，提示AngⅡ刺激后心肌细胞凋亡。adCREG+AngⅡ组Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达明显低于adcon+AngⅡ组，而Bcl-2蛋白表达明显高于adcon+AngⅡ组，差异有统计学意义(P<0.01)，提示CREG过表达可抑制AngⅡ引起的心肌细胞凋亡。见图3。

图3 CREG过表达对AngⅡ刺激后小鼠原代心肌细胞凋亡的影响

3 讨论

心力衰竭是严重威胁人类健康的疾病之一，是许多心血管疾病的终末阶段。虽然，科研工作者对心力衰竭的发病机制进行了大量的深入研究，但心力衰竭的发病率仍然很高。心肌细胞凋亡是心力衰竭的主要病理机制[16-18]。因此，明确心肌细胞凋亡的关键调控分子，对于深入阐明心力衰竭的发病机制，以及寻找新的干预和治疗靶点，将具有非常重要的意义。

CREG是一个在组织和细胞中广泛表达的小分子糖蛋白，具有维持组织细胞分化稳态调控的作用。本实验室长期致力于CREG在心血管疾病中的研究。既往研究证实，CREG具有重要的心血管保护作用：(1)CREG在心脏组织中高表达；(2)CREG在小鼠心肌缺血再灌注的心肌组织中表达下降，并且外源性给予CREG重组蛋白可通过调控心肌细胞自噬功能来改善小鼠心肌缺血再灌注损伤[10]；(3)CREG表达降低可加重心肌梗死后心功能损伤，增加梗死后心肌纤维化，而外源性给予CREG重组蛋白后可改善心肌梗死后心功能，并显著减轻梗死后心肌纤维化[13]；(4)CREG过表达可改善AngⅡ诱导后心肌细胞的自噬功能[15]。

本研究采用AngⅡ刺激小鼠心肌细胞来建立心力衰竭的细胞学模型[19-20]。本研究结果发现，AngⅡ刺激后，CREG蛋白表达明显下降，凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3和Bax蛋白表达升高，提示CREG表达可能与AngⅡ引起的心肌细胞凋亡存在一定的相关性。为进一步明确CREG在AngⅡ诱导心肌细胞凋亡中的作用，首先使用CREG过表达腺病毒感染细胞建立CREG过表达的心肌细胞，在后续的研究中发现，CREG过表达可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡。本研究的结果与以往研究结果[11-15]一致，提示CREG是一个重要的心肌保护因子。

本研究存在一定的局限性。在本研究中，AngⅡ刺激后CREG基因mRNA表达无变化，而蛋白表达水平却显著下降，提示AngⅡ刺激后，CREG表达水平变化是发生在转录后，在蛋白降解层面出现异常，后续工作中可深入研究AngⅡ刺激后CREG蛋白降解的相关途径，如蛋白酶体途径或溶酶体途径。此外，本研究结果表明CREG过表达可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡，但具体机制仍不清楚，CREG是否通过影响某些凋亡相关的信号通路发挥作用有待进一步深入研究。

综上所述，AngⅡ刺激后降低心肌细胞中CREG蛋白表达，CREG过表达后可显著抑制AngⅡ引起的心肌细胞凋亡。本研究将为深入明确心力衰竭的发病机制、寻找新的防治靶点提供理论支撑。