不同DNA提取方法对高通量测序检测沉积物微生物多样性的影响

王志龙，李春筱，蔡一鸣，夏雪山，刘 丽

（昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

0 引言

湖泊富营养化是全球水环境面临的重大问题，湖泊沉积物作为水体营养物质的主要来源直接影响着水体富营养化［1］.沉积物和水体中微生物群落通过参与营养物质的转化、降解，推动物质循环、能量流动进而影响着整个湖泊生态系统［2-3］.因此，沉积物的微生物群落分析对于研究湖泊环境变化有极为重要的意义.

近年来，高通量测序的兴起使全面分析环境微生物群落成为微生物研究的热点.通过测序分析可检测样品中的优势微生物类群及群落中的稀有物种等，进而阐明微生物多样性［4-5］.然而，获得高质量的基因组DNA是高通量测序的基础［6］.湖泊沉积物中因存在大量的腐殖酸、多糖和盐类等不易去除的杂质，导致DNA提取的效率和质量以及后续的测序会受到严重影响［7］.目前，对于沉积物基因组DNA提取的方法主要有：手提法、试剂盒法以及二者相结合的方法.手提法是使用类似CTAB、SDS、溶菌酶、蛋白酶K等具有裂解细胞或降解蛋白质作用的试剂，使DNA游离；或者加入聚乙二醇（PEG）诱导大分子沉淀，从而提高DNA质量；去腐剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）能够去除沉积物中的腐殖酸和多酚等杂质.试剂盒法是通过使用生物公司生产的商业试剂盒，对沉积物基因组DNA进行提取，虽然DNA提取浓度相比手提法较低，但是操作步骤简单便捷.

不同DNA提取方法会影响不同环境样品的提取效率和产率.当前针对去除沉积物中的杂质从而提高DNA提取质量的研究多限于在DNA浓度或一代测序上进行比较，而对基于16S／18SrRNA扩增子测序的研究少之又少，对湖泊沉积物DNA不同提取方法的高通量测序分析到目前尚未报道［8-11］.因此，采用高通量测序的方法确定出一种针对云南高原湖泊沉积物质量高、代表性强、物种多样性高、物种均匀度高的基因组DNA的提取方法是研究其微生物多样性和群落构成的基础.

本研究以云南高原湖泊滇池沉积物为研究对象，选取文献中发表的8种常用DNA提取方法（2种试剂盒法、4种手提法、2种手提与试剂盒结合法）提取沉积物基因组DNA，进行DNA质量和得率比较.选择其中较好的四种方法，进行16S／18SrRNA基因扩增子测序，通过对其OTU分布、Alpha和Beta多样性及物种等的全面比较分析，确定出适合云南高原湖泊沉积物总DNA的提取方法，以期为湖泊沉积物中微生物群落结构多样性的研究奠定基础.

1 材料和方法

1.1 沉积物样品采集

2019年6月采集云南滇池表层沉积物，重复采样3次.采样点为CH（102°39′1″E，24°59′17″N）；HG（102°39′11″E，24°57′47″N）；HD（102°43′53″E，24°55′36″N）；LYH（102°45′48″E，24°49′36″N），混合均匀后将样品置于密封袋避光保存，低温箱运送至实验室，置于-80℃冰箱保存.

1.2 湖泊沉积物总基因组DNA提取

采用8种方法分别对湖泊沉积物样品进行基因组DNA提取，每个样品重复提取3次.

1.2.1 试剂盒法

S-MOBIO试剂盒法：称取3g沉积物样品，使用MOBIO土壤核酸试剂盒（DNeasy®PowerSoil®Kit（MOBIO））提取沉积物中基因组DNA，实验根据试剂盒说明书进行操作.提取的DNA置于-80℃保存.

S-OMEGA试剂盒法：称取3g沉积物样品，使用OMEGA土壤DNA提取试剂盒（E.Z.N.A®Soil DNA Kit（OMEGA））提取沉积物中基因组DNA，按照试剂盒说明书进行操作.提取的DNA置于-80℃保存.

1.2.2 手提法

蛋白酶K-SDS-PEG一次沉淀法：参照文献［12］，并进行部分步骤的优化.称取3g沉积物样品，加入6 mL DNA提取液（100 mmol／L Tris-HCl，100 mmol／L EDTA，100 mmol／L磷酸钠，1.5 mol／L NaCl，1%CTAB，pH＝8.0）.加入蛋白酶K至终浓度为0.2 mg／mL，37℃，225 r／min振荡1h.加入20% SDS混匀，65℃水浴2 h.室温下12 000×g离心10 min，收集上清.加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1），4℃，12 000×g离心10 min，收集上清.加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24∶1），4℃，12 000×g离心10 min，收集上清.加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2 h.4℃，12 000×g离心10 min，弃上清，收集DNA沉淀，沉淀用-20℃预冷的70%乙醇750μL轻轻冲洗2次.4℃，12 000×g离心5 min，弃上清，沉淀晾干.用100μL TE缓冲液溶解DNA，收集于1.5 mL离心管中，保存于-80℃冰箱.

溶菌酶-SDS-PEG二次沉淀法：参照文献［13］，并进行部分步骤的优化.称取3g沉积物样品，加入6 mL DNA提取液，涡旋5 min.加入溶菌酶至终浓度为2 mg／mL，37℃，225 r／min振荡1h.加入20% SDS混匀，65℃水浴2 h.室温下8000×g离心10 min收集上清，加入0.5倍体积的40% PEG 8 000混匀，4℃沉淀过夜.4℃，12 000×g离心20 min，收集沉淀.沉淀加入600μL TE缓冲液溶解，转入1.5 mL离心管，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1），4℃，12 000×g离心10 min收集上清.加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24∶1），4℃，12 000×g离心15 min，收集上清.加入0.1倍体积的5 mol／L的CH3COONa和0.6倍体积-20℃预冷的异丙醇室温沉淀4 h，4℃，12 000×g离心15 min，弃上清.沉淀用-20℃预冷的70%乙醇2次洗涤，4℃，12 000×g离心5 min，弃上清，沉淀晾干.加200μL TE缓冲液溶解DNA，收集于1.5 mL离心管中，保存于-80℃冰箱.

蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）：将溶菌酶-SDS-PEG二次沉淀法中“加入溶菌酶至终浓度为2 mg／mL”换成“加入蛋白酶K至终浓度为0.2 mg／mL”.

去腐剂-蛋白酶K和溶菌酶结合法：参照文献［15］，并进行部分步骤的优化.分别取3 g沉积物样品于10 mL离心管，加入去腐剂6 mL，涡旋混合（5 min）直至样品被打散.60℃水浴5 min，再涡旋数秒.12 000×g离心5 min.如果上清液颜色较深反复去腐2～3次直至上清液颜色变淡，加入2倍体积的DNA提取液，50μL蛋白K（10 mg／mL）和50μL溶菌酶（10 mg／mL）；37℃下200 r／min涡旋振荡1.5 h，加入2 mL PVPP溶液涡旋混匀，65℃水浴2 h，12 000×g离心10 min取上清，在所得沉淀中再加入1 mL DNA提取液，0.1 mL 20% SDS涡旋10 s，80℃水浴10 min，离心取上清，合并上清，与酚-氯仿-异戊醇等体积抽提，再用氯仿-异戊醇试剂等体积抽提，取上层液以0.6倍体积的异丙醇沉淀过夜.12 000×g离心1 h，用70%冰乙醇洗涤沉淀，离心40 min，弃上清液.待DNA干燥4 h后溶于100μL TE缓冲液中，保存于-80℃冰箱.

1.2.3 手提结合试剂盒法

去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法（S-CTAB）：参照文献［15］，并进行部分步骤的优化.分别取0.5 g样品于2mL离心管，加入去腐剂1 mL，涡旋混合5 min，直至样品被打散.60℃水浴5 min，再涡旋数秒.12 000×g离心5 min，确保上清液颜色变淡.加入1 mL CTAB提取液，加入蛋白酶K至终浓度为0.2 mg／mL，涡旋混匀5 min后，37℃225 r／min摇床上振荡1 h（期间振荡5～8次）.加入20% SDS（至终浓度为2%），65℃水浴2 h，期间每15 min轻轻颠倒混匀.室温条件12 000×g离心10 min，收集上清.加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，4℃，12 000×g离心10 min，收集上清，重复此步骤一次.加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2 h.4℃，12 000×g离心15 min，沉淀DNA.小心弃掉上清液，确保不要碰触底部DNA沉淀.后续操作使用OMEGA E.Z.N.A Water DNA试剂盒进行.

去腐剂-CTAB-溶菌酶-试剂盒法：将去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法中“加入蛋白酶K至终浓度为0.2 mg／mL”换为“50μL蛋白酶K（10 mg／mL）和50μL溶菌酶（10 mg／mL）”.

1.3 总基因组DNA质量的测定

使用超微量分光光度计（天根生化科技（北京）有限公司）对用8种方法提取的沉积物总基因组DNA进行OD260／OD280值和浓度的测定，并观察DNA的状态.

1.4 高通量测序

选取S-MOBIO试剂盒法、S-OMEGA试剂盒法、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法、去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法提取的HD采样点沉积物总基因组DNA为模板，原核微生物选择16SrRNA的V3-V4区通用引物341F和805R，目的片段长度465bp；真核微生物选择18S rRNA的V4区通用引物TAReuk454FWD1和TAReukREV3，目的片段长度420bp［16］.使用文献中的引物和条件对序列进行PCR扩增，PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测.对目标片段进行回收，回收采用AxyPrep PCR Clean up Kit回收试剂盒.对纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Qbit荧光定量系统上对文库进行定量，合格的文库浓度应在2nM以上.将合格的各上机测序文库（Index序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH 变性为单链进行上机测序；测序平台采用Illumina Miseq测序仪进行2×300bp的双端测序，相应试剂为MiSeq Reagent Kit.

1.5 原始数据拼接及质量控制

采用FLASH（v1.2.8）软件，根据双端序列的overlap关系，将序列拼接（merge）成长的tag，并将序列上建库引入的barcode和引物序列去除，然后采用Vsearch（v2.3.4）过滤嵌合体，得到高质量的序列用于生物信息学分析.

1.6 生物信息学分析

预处理之后的clean data使用Vsearch将序列相似性大于97%的clean tags定为一个OTU，确定最佳的centroids（位于几何中心）序列作为该OTU的代表序列.使用QIIME（v1.8.0）分析Alpha多样性以及Beta多样性.使用Blast进行分类对比，16S rRNA通过与RDP（核糖体）数据库和NT-16S数据库进行物种注释；18SrRNA通过SILVAv132数据库进行物种注释.

2 结果与分析

2.1 不同DNA提取方法的比较

OD260／OD280值通常作为检测DNA纯度的指标，高纯度的DNA OD260／OD280值一般在1.7～2.0之间［18］.由表1可知，各种提取方法提取的DNA效果不同，S-MOBIO试剂盒法、S-OMEGA试剂盒法、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法、去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法提取DNA OD260／OD280值为1.763～1.941，效果较好.其他方法提取的DNA纯度不高，存在多酚和蛋白质的污染.DNA的颜色也是判断DNA纯度的指标［18］.蛋白酶K-SDS-PEG一次沉淀法所得的DNA为浅黄或黄褐色，说明所提取的DNA含有大量的腐殖酸，溶菌酶-SDS-PEG二次沉淀法、去腐剂-蛋白酶K和溶菌酶结合法、去腐剂-CTAB-溶菌酶-试剂盒法提取的DNA纯度或浓度较低.后续研究选用S-MOBIO试剂盒法、S-OMEGA试剂盒法、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法、去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法四种方法提取的DNA进行高通量测序.

表1 不同方法提取DNA的状态和指标Tab.1 Different methods for extracting DNA status and indicators

2.2 扩增子测序数据的比较分析

2.2.1 OTU分析

为便于研究微生物群落结构，研究选用上述四种方法提取的HD采样点的DNA进行16S／18S rRNA扩增子测序分析.按照相似度为97%将测序获得的有效序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units）［19］，得到每个cluster的序列及其代表序列（OTU），用于统计每个OTU序列和丰度进行下游分析.

四种提取方法的OTU分布Venn图如图1所示，原核微生物（图1a）中S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）、去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法（SCTAB）、S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）注释到的OTU数量分别为4 365、4 418、3 014、1 937；真核微生物（图1b）中分别为444、576、373、188.其中蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法注释到的特有OTU数量最多，原核微生物和真核微生物分别为318、226；且S-MOBIO试剂盒法与蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法的共有OTU数量最多，原核微生物和真核微生物分别为1 407、211.S-OMEGA试剂盒法是特有OTU数量及与其他方法共有OTU数量最低的，表示该方法所注释到的物种种类少且与其他方法注释到的物种相似性不高.

图1 四种方法的OTU分布Venn图Fig.1 Venn diagrams of OUT distribution of the four methods

2.2.2 Alpha多样性分析

Alpha多样性主要反映物种的丰富度、均匀度、测序深度等，从Alpha稀释曲线可以看出（图2），随着数据量的增加，四种方法对应的Chao1指数先是剧烈增加随后趋于平坦，测序数据量接近饱和，说明测序深度已足以反映样品信息.不同提取方法测序的Alpha多样性指数见表2，Goods-coverage数值在0.98～1.00之间，表明四种方法所提取的DNA的测序结果均能够代表样本真实情况.S-MOBIO试剂盒法（SMOBIO）、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）在原核微生物和真核微生物中Chao1和Observed species数值均为最高的，表明这两种方法所提取的DNA样本中包含的物种更为丰富.

图2 四种方法的Alpha稀释曲线Fig.2 Alpha dilution curve of the four methods

Simpson、Shannon指数主要综合体现物种的丰富度（Richness）和均匀度（Evenness）.从表2中可以看出，S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）在原核微生物和真核微生物中Simpson和Shannon指数也均为最高的，且滇池中原核微生物的物种多样性大于真核微生物的物种多样性，S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）物种多样性最低.通过以上五种指数的分析，认为S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）提取的DNA能更好地代表样本中物种的丰富度.

表2 四种方法的Alpha多样性指数Tab.2 Alpha diversity index of the four methods

2.2.3 Bate多样性分析

通过unweighted unifrac的聚类来分析由DNA提取方法不同所产生的群落构成差别而导致的样品间的差异，在原核微生物（图3a）和真核微生物（图3b）中S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）与蛋白酶KSDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）分枝长度比较短，表明两种方法的群落构成很相似；而去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法（S-CTAB）和S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）在不同分枝上且分枝长度较长，说明群落组成差别较大.

图3 四种方法的UPGMA聚类分析图Fig.3 UPGMA cluster analysis graph of the four methods

主坐标PCoA分析可最大化展示样品之间的相似性或差异性，将群落结构相似度高的样品聚集在一起，差异大的样品则距离较远.从PCoA分析结果（图4）可以看出，对高维特征空间进行降维处理后PCo1的贡献率均在53%以上，原核微生物（图4a）和真核微生物（图4b）中S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）相距较近，聚集在一起，表明这两种样品之间物种组成结构更为相似；而去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法（S-CTAB）和S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）距离较远，与其他方法的物种之间存在着一定的差异性.

图4 四种方法的PCoA图Fig.4 PCoA diagram of the four methods

2.3 微生物群落组成分析

根据样品的物种丰富度，选取丰度最高的20个物种分类，剩余物种归一类为Others，进行原核微生物和真核生物门、属水平物种分类分析.原核微生物门、属水平分类如图5所示，四种方法在原核微生物中门（图5a）、属（图5b）水平差异较小：均以变形菌门（Proteobacteria）为第一丰度优势菌门，在门、属水平上物种分类相似，只是丰度不同.但在真核微生物门（图6a）、属（图6b）水平上的差异明显：去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法（S-CTAB）和S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）注释到的真核微生物门水平物种较少，尤其是S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）只注释到了6种门分类，比S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）注释到的物种较少.S-MOBIO试剂盒法（SMOBIO）和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）以纤毛门（Ciliophora）为第一优势门，而SOMEGA试剂盒法（S-OMEGA）和去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法（S-CTAB）有其他方法注释到特别少的节肢动物门（Arthropoda）和脊椎动物门（Vertebrata）.由图6b所示，S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）所代表的方法之间属的分类差别不大，都是以端毛虫属（Telotrochidium）、钟虫属（Vorticella）、落葵属（Basella）为主要真核微生物属水平分类；而SCTAB以其他方法很少注释的未分类的哺乳动物纲（Mammalia-unidentified）和未分类的辐鳍鱼纲（Actinopterygii-unidentified）为主，S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）以其他方法几乎没有注释的河八王属（Narenga）和未分类的蛛形纲（Arachnida-unidentified）为主.四种方法所表示的门、属分类水平真核微生物差异比原核微生物明显.

图5 原核微生物物种分类柱状堆叠图Fig.5 Stacked bar chart of prokaryotic species classification

图6 真核微生物物种分类柱状堆叠图Fig.6 Stacked bar chart of eukaryotic species classification

3 讨论

从环境中提取高质量的DNA是高通量测序研究环境微生物多样性的关键步骤.本研究采用8种不同方法进行DNA提取，所得到的DNA质量互有差异，这与细胞裂解不完全、污染物去除不彻底等因素有关［20］.试剂盒法提取的DNA其OD260／OD280值在1.8附近，DNA浓度数值也较为稳定，说明这两种试剂盒提取方法较为优良.比较手提法表明，二次沉淀要优于一次沉淀，原因是PEG8000能够诱导溶液中大分子聚集从而更好地沉淀DNA，提高DNA的浓度［21］.蛋白酶K的提取效果优于溶菌酶，原因是SDS具有分离蛋白质的作用，搭配蛋白酶K可以更好地降解蛋白质［22］.使用去腐剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可以有效地去除多酚，PVP与多酚形成复杂的氢键，并有效地将其与DNA分离，提高DNA提取效率［23］.由于去腐剂-蛋白酶K和溶菌酶结合法中欠缺专一去除腐殖酸或其他影响DNA提取率的试剂，所以提取的DNA中有絮状沉淀，且OD260／OD280值较低.去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法和去腐剂-CTAB-溶菌酶-试剂盒法提取的DNA均为透明易溶状态，但去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法提取的DNA OD260／OD280值相比去腐剂-CTAB-溶菌酶-试剂盒法较理想，DNA浓度也较高，主要原因在于蛋白酶K和溶菌酶的提取效果差异.相比之下，DNA产量、纯度受DNA提取方法的影响较大，其中S-MOBIO试剂盒法（SMOBIO）、S-OMEGA试剂盒法（S-OMEGA）、蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）、去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法（S-CTAB）四种方法提取的DNA质量更高.

现有的湖泊沉积物DNA提取方法主要基于DNA提取浓度、纯度等进行比较，尚无对高通量测序结果影响的研究.本文通过对较理想的4种DNA提取方法进行扩增子测序，探究不同DNA提取方法对原核微生物、真核微生物群落的影响.根据扩增子测序数据分析表明，S-MOBIO试剂盒法和蛋白酶K-SDSPEG二次沉淀法注释的OUT数最高，与其他方法共有的OTU数量也较多；说明这两种方法提取到的DNA包含了其他方法所提取到的大部分物种的DNA.而蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法特有的OTU数量较多，说明该方法能提取到其他方法提取不到的物种DNA，这也为筛选到新的未被报道的且有研究价值的菌群提供了可能.同时Alpha多样性和Beta多样性分析表明，不管是物种丰富度、均匀度和测序深度，还是物种差异性分析，S-MOBIO试剂盒法和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法两种方法提取的DNA较为理想.贺惠等［24］使用不同沉积物基因组DNA提取方法对中国山东半岛海域海洋沉积物基因组进行提取，结果表明MOBIO DNeasy®PowerSoil®Kit（本文中S-MOBIO试剂盒法）在DNA纯度、得率、16SrRNA基因拷贝数和微生物群落特征等多方面表现良好.王淑娟等［25］使用不同沉积物基因组DNA提取方法对黄河三角洲土壤进行沉积物基因组DNA提取，研究表明SDS法（本文中蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法）得到纯度较高质量较好的沉积物DNA样品.

根据物种分析，无论是门水平还是属水平，不同DNA提取方法对微生物群落组成有明显差异.四种方法对于原核微生物物种影响差别不大，只是丰度不同；但四种方法对于真核微生物门属水平的影响较大，S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）两种方法注释到的真核微生物丰度相似度高.去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法注释到脊椎动物门丰度最高和S-OMEGA试剂盒法注释到高丰度节肢动物门，这是S-MOBIO试剂盒法和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法很少注释到的门水平物种.去腐剂-CTAB-蛋白酶K-试剂盒法注释到其他几种方法很少注释到的未分类的哺乳动物纲和未分类的辐鳍鱼纲，S-OMEGA试剂盒法注释到其他方法几乎没有的河八王属和未分类的蛛形纲，并且这些属为主要属水平物种，与S-MOBIO试剂盒法和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法主要属水平物种完全不一致.本研究表明，不同DNA提取方法使用不同试剂，可能对特异性微生物的偏好不同，尤其对真核生物的测序影响较大.John等［26］研究发现，不同的细胞裂解方式在真核生物群落中存在差异.Mahmoudi等在研究不同沉积物基因组DNA提取方法时发现，不同提取方法对真核生物多样性分析存在较大差异［27］.因此，如何开展真核生物分子生态学研究，尚需进一步分析具体DNA提取试剂的影响，以期更加全面评价真核微生物群落组成.

4 结论

不同的DNA提取方法对微生物群落的多样性有较大的影响，适宜的DNA提取方法能够得到较大数量的OUT和较为完整的生物多样性.通过对DNA质量及扩增子测序结果分析表明，S-MOBIO试剂盒法（S-MOBIO）试剂盒法和蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法（S-SDS-PEG）手提法是适合云南高原湖泊沉积物DNA提取的较好方法.其中，S-MOBIO试剂盒法试剂盒具有操作方便，DNA纯度较高，污染较少等优点，蛋白酶K-SDS-PEG二次沉淀法手提法可以获得较高的DNA浓度.