液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中四环素类药物残留量方法优化

2021-11-06◎黄英

现代食品 2021年17期

◎ 黄英

（深圳信测标准技术服务有限公司，广东深圳 518000）

四环素类药物是一种广谱抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素、强力霉素等，对革兰氏阴性需氧菌和厌氧菌、立克次体、螺旋体及某些原虫等有抗菌作用，常用于预防和治疗动物疾病[1]。但由于部分养殖人员为追求经济利益，不加以控制地使用四环素类药物，导致药物在动物体内残留，食用后直接危害到人们的身体健康[2]。为此，我国连续几年将金霉素、土霉素、四环素、强力霉素列入食品安全风险监测范围，并加大对市场流通的畜禽产品抽查。目前，检测金霉素、土霉素、四环素、强力霉素的方法有微生物学法、酶联免疫法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法[3]，对比这几种方法，液相色谱-串联质谱法准确度较高。本文参照国家标准[4-5]，对液相色谱-串联质谱法的前处理方法和仪器采集方法作出优化。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

柠檬酸、磷酸氢二钠、乙酸乙酯，分析纯，大茂化学试剂厂；乙二胺四乙酸二钠，分析纯，福晨化学试剂有限公司；甲酸，质谱纯，Fisher；甲醇、乙腈，质谱纯，坛墨质检；四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准溶液（100 μg·mL-1），农业部环境保护科研检测所；BRP固相萃取柱（60 mg/3 mL），月旭。

1.2 设备

AB SCIEX液相色谱质谱联用仪（上海硅仪生化科技有限公司）、氮吹仪（北京恒奥德仪器仪表有限公司）、离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）、超声机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）、天平（上海精其仪器有限公司）、搅拌机（美的）和pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）[4]。

1.3 方法

1.3.1 配制标准曲线浓度

取四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准溶液各0.10 mL，用甲醇+水（1+9）定容至10 mL作为标准混合使用液。用甲醇+水（1+9）（含0.2%甲酸）稀释标准混合使用液，配制浓度为5～250 ng·mL-1，作标准曲线。

1.3.2 样品提取

称取均质鸡肉试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管，用约50 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液（0.1 mol·L-1pH=4.0）分3次冰水浴超声提取，每次旋涡10 min，超声提取10 min，3 200 r·min-1离心8 min，合并上清液并定容至50 mL，混匀，3 200 r·min-1离心10 min，用快速滤纸过滤（离心时温度低于15 ℃）。

1.3.3 样品净化与浓缩

准确吸取10 mL提取液，以1滴/s的速度过BRP固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇+水（1+19）淋洗，弃去全部流出液，减压抽干1 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯（1+9）洗脱，洗脱液氮吹浓缩至近干，用1.0 mL甲醇+水（1+9）（含0.2%甲酸）溶解残渣，经0.22 μm滤膜过滤，待测定。

1.4 液质条件

1.4.1 液相条件

色谱柱C18（3.0×100 mm，2.6 μm）；流速0.35 mL·min-1；柱温40 ℃；流动相A：0.2%甲酸水；流动相B：0.2%甲酸-甲醇；洗脱梯度：0 min 95%A，1.0 min 85%A，2.0 min 60%A，5.0 min 10%A，6.0 min 60% A，6.1 min 95%A，8.0 min 95%A。

1.4.2 质谱条件

ESI+离子化；MRM扫描；离子源：电压5 500 V，温度500 ℃；碰撞气8 psi。

2 结果与分析

2.1 前处理方法

样品净化使用了BRP固相萃取柱，吸附容量是C18键合硅胶固定相的3～10倍，相当于Oasis® HLB固相萃取柱，可达到较好的净化效果。考虑到液质方法中流动相为0.2%甲酸水和0.2%甲酸-甲醇，所以浓缩后残渣用甲醇+水（1+9，含0.2%甲酸）溶解[5]。

2.2 色谱质谱条件的优化

考虑到三氟乙酸可能引起信号抑制，采用甲酸代替三氟乙酸配成0.2%甲酸水溶液作为水相。将金霉素、土霉素、四环素、强力霉素混合标准溶液注入质谱仪中，在SIM和Product Ion模式下，得到母离子和相应的离子碎片；在MRM模式下，优化锥孔电压和碰撞能量，优化后的母离子、子离子、碰撞电压参数见表1，其MRM色谱图见图1。

图1 4种混合标准溶液的MRM色谱图

表1 四环素类药物参数表

2.3 线性关系及检出限

将1.3.1配制浓度在1.4与2.2条件下测定，以峰面积对应的浓度进行线性回归，线性关系见表2。根据信噪比S/N≥3和S/N≥10计算检出限和定量限分别为5 μg·kg-1、10 μg·kg-1。

表2 四环素类药物线性方程及相关系数表

2.4 回收率及精密度

取16份鸡肉样品各5 g，分为3组，分别添加标准混合使用液0.05 mL、0.50 mL、1.00 mL 3个水平，按照1.3.2与1.3.3方法操作，在1.4与2.2条件下上机测定，计算3组浓度的回收率及精密度，结果见表3。

表3 回收率及精密度结果表

2.5 实例

2021年实验室采用该方法对大连中食国实检测技术有限公司进行能力验证，即鸡肉中四环素、土霉素、金霉素和强力霉素残留量的测定。检测结果显示，四环素类药物含量为0.345～1.16 mg·kg-1，RSD为0.12%～6.08%，回收率为86.15%～102.00%，Z值为-0.44～1.27，结果均为满意。