甲胎蛋白AFP的原核表达、纯化及鉴定

2021-11-06王桂玲吴胜昔谷志鹏龚吕鸿

重庆理工大学学报(自然科学) 2021年10期

王桂玲，冉皑，吴胜昔，谷志鹏，黄蕾，龚吕鸿

(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)又称“癌中之王”，是一种常见且致死率极高的恶性肿瘤，在全球恶性肿瘤死亡率中高居第三，严重威胁人类的健康和生命[1]。我国每年约39万人罹患肝癌死亡，数量超过全球肝癌死亡人数的一半。肝癌侵袭力强，经手术切除、肝移植后，患者5年的生存率仅为70%，加上肝癌的预后较差，复发风险较高，因此HCC的早期诊断意义重大[2]。

人甲胎蛋白(alpha-Fetoprotein，AFP)是1个分子量约为70 kDa的糖蛋白，含有591个氨基酸，属白蛋白家族，源于胚胎内胚层组织细胞，主要由胎儿肝细胞及卵黄囊合成[3]。当胎儿发育至12～16周时，可在胎儿的血液循环中检测到高达3 g/L的AFP，妊娠30周达到最高峰，之后逐渐下降。胎儿出生2～3月后，随着干细胞表达下降，体内的AFP转变为白蛋白且在血清中只能检测到微量的AFP蛋白，出生后的第二年接近成人水平，正常人血清中AFP的含量会维持在1个较低水平(<20 μg/L)[4-6]。1964年，前苏联专家Wong等[7]在肝癌患者血清中首次发现AFP，截至目前，AFP被认为是肝癌诊断的最佳生物标志物。肝癌患者表现出临床症状的前8个月时，血清中AFP的含量已经显著升高，因此AFP在临床上广泛用于原发性肝癌的诊断及疗效监测。AFP具有很多重要的生理功能，如运输功能、免疫抑制、T淋巴细胞诱导凋亡、作为生长调节因子的双向调节功能等[8]。血清中AFP浓度的异常增高与多种恶性疾病的发展有密切关系，血清中AFP>400 μg/L并持续一个月以上则提示肝癌高风险。AFP可用于评估肝癌的预后性，浓度升高则提示预后不良。此外，AFP还可用于肝癌高危人群的筛查[9]，乙型肝炎性或丙型肝炎性、肝硬化患者每6个月进行一次血清AFP的跟踪随访和腹部超声。目前，肝癌血清标志物AFP的检测方法主要以抗原抗体发生免疫结合反应为基础，然而国内生产的AFP检测试剂的质量不一，国外进口价格昂贵。因此，制备纯度高、特异性强、成本较低的AFP蛋白可为肝癌的早期快速检测提供有效试剂。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

BL21(DE3)感受态细胞购于上海唯地生物科技有限公司；pET28a(+)质粒载体由重庆理工大学基因工程实验室赠予；pET28a(+)-AFP质粒、pET28a(+)-AFP/DH5α甘油菌是由苏州金唯智生物科技有限公司构建。

1.2 主要试剂及仪器

DNA Marker、QuickCut NdeI、QuickCut XholI限制性内切酶购自TaKaRa；小型质粒提取试剂盒购自北京博迈德基因技术有限公司；6×Loading Buffer购自北京金克隆生物技术有限公司；蛋白质分子质量标准购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；卡那霉素和IPTG分别购自赛国生物科技有限责任公司和美国Genview公司；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液购自biosharp公司；HRP-羊抗小鼠IgG购自美国Proteintech公司；BCA蛋白定量测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；NGC蛋白纯化系统购自美国伯乐生命医学(上海)分公司；Nano-300微量核酸蛋白检测仪购自上海嘉鹏科技有限公司；Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪购自美国GE公司。

1.3 序列分析与合成

根据GenBank上发布的AFP全基因序列(GenBank登录号：NM_001134.2)，对AFP基因序列分析及大肠杆菌密码子偏好性优化，在AFP全长基因序列的C-端及N-端各加一组6×His-Tag，以pET28a(+)作为原核表达载体。交由苏州金唯智公司进行基因构建与合成。

1.4 pET28a(+)-AFP重组质粒的酶切与鉴定

用接种环蘸取少量pET28a(+)-AFP/DH5α甘油菌，划线接种于LB固体培养基(含有50 μg/mL卡拉霉素)，37 ℃培养30 min后倒置培养过夜。次日，挑取单菌落并接种于5 mL的LB液体培养基试管(含50 μg/mL卡拉霉素)，37 ℃，180 rpm，振荡培养12 h，测量菌液的OD600值达0.6～0.8时，利用质粒小量提取试剂盒进行重组质粒的提取。测定pET28a(+)-AFP重组质粒的浓度，确保在下述酶切反应体系中质粒数量可达500～1 000 ng。利用快切酶NdeI、XholI进行双酶切鉴定，反应体系如表1所示，37 ℃酶切反应30 min。对双酶切产物进行0.7%琼脂糖凝胶电泳鉴定，100 V，80 mA，电泳30 min。

表1 pET28a(+)-AFP的双酶切体系

1.5 重组质粒的转化及重组菌的保存

将重组质粒以热激法转入大肠杆菌感受态细胞，具体操作参照文献[10-11]。将转化成功后的pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)进行菌种保存，具体操作步骤如下：挑取平板上大而饱满的单菌落，接种到5 mL的LB液体培养基，37 ℃，180 r/min恒温振荡培养过夜，次日，将试管中的菌液同30%甘油溶液(经高压灭菌)按1∶1的比例混匀，长期保存于-80 ℃。

1.6 pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重组蛋白的表达与鉴定

按上述步骤对pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重组工程菌进行单菌落培养并接种至5 mL LB液体培养基，待菌液培养至指数生长期，加入适量浓度的IPTG，150 r/min，诱导扩增8 h。对诱导表达的菌液进行超声破碎，10 000 r/min离心2 min，弃上清，将菌体沉淀用适量的灭菌水重悬，取20 μL沉淀悬液与5 μL 5×SDS上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸变性10 min，进行SDS-PAGE电泳鉴定。空载体按照相同条件处理。

1.7 pET28a(+)-AFP重组蛋白诱导表达条件筛选

pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重组工程菌划线接种并培养至5 mL试管，37 ℃振荡培养至菌液的OD600值达0.6～0.8时，将各试管按诱导温度梯度(16、25、30、37 ℃)、IPTG浓度梯度(0.1、0.3、0.5、0.75、1 mmol/L)及时间梯度(2、4、6、8、10、12 h)进行诱导条件筛选。利用SDS-PAGE电泳对样品进行鉴定，从而得到AFP重组蛋白大量表达的最佳诱导表条件。

1.8 pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)重组工程菌的扩大培养

按照上述步骤扩大培养AFP重组基因工程菌后，根据筛得的最佳诱导条件使菌液大量表达AFP重组蛋白。

1.9 重组蛋白pET28a(+)-AFP包涵体的处理及纯化AFP重组蛋白

1.9.1包涵体处理

按上述步骤对pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)工程菌进行二次活化，以最佳诱导条件大量表达AFP重组蛋白，10 000 rpm，4 ℃离心10 min后弃上清，向沉淀中加入PBS(1∶30)。10 000 rpm，4 ℃离心10 min后弃上清，向沉淀中加入裂解液(1∶20)和PMSF(1∶100)，超声破菌，14 000 rpm，4 ℃低温离心15 min后弃上清并收集包涵体沉淀。向沉淀中加入裂解液(1∶30)，涡旋至沉淀溶解。14 000 rpm，4 ℃离心15 min后弃上清。向沉淀中加入8M尿素(1∶30)，4 ℃低速搅拌15 h。将溶解的产物离心(14 000 rpm，4 ℃离心10 min)并收集上清(包涵体粗提液)。

1.9.2亲和层析镍柱纯化AFP重组蛋白

利用NGCTMChromatography System对pET28a(+)-AFP重组蛋白包涵体进行亲和层析纯化，具体操作步骤见文献[12]。

1.10 AFP重组蛋白的Western blot鉴定

取20 μL纯化后的蛋白样品与5 μL 5×SDS上样缓冲液，涡旋仪混匀后置沸水中变性10 min，然后进行SDS-PAGR电泳鉴定。按照Western blot步骤[13]对纯化后的蛋白样品进行特异性鉴定。

1.11 AFP重组蛋白样品的浓度测定

按照北京鼎国昌盛BCA蛋白浓度测定试剂盒的步骤测定AFP重组蛋白样品的浓度，具体操作如下：

1) 配制BSA蛋白标准品溶液：用灭菌的双蒸水稀释蛋白标准品至0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL；

2)稀释后的蛋白标准品按照10 μL/孔逐次加到96孔板中，加入10 μL待测蛋白样品，每个样品做3个平行组；

3) 将试剂盒中A液和B液按照50∶1的比例配制工作液，200 μL/孔，将96孔板置37 ℃恒温培养箱中孵育30 min；

4) 提前预热MULTISKAN GO分光光度仪，在562 nm下测得该样品的OD562值，绘制标准曲线以测定AFP重组蛋白的浓度。

2 实验结果

2.1 酶切鉴定结果

用限制性核酸内切酶Nde I和Xhol I对重组质粒pET28a(+)-AFP进行双酶切鉴定，结果如图1所示，在1 875 bp(目的基因)及5 369 bp(空载体pET28a(+))处均出现了核酸电泳条带，此结果与预期相符合，证明pET28a(+)-AFP重组质粒构建成功。测序结果表明该克隆序列各连接位点及阅读框架正确，与预期相符合。

M：DNA分子质量标准；1-2：未酶切质粒；3-4：重组质粒经Nde I、Xhol I双酶切图1 重组质粒pET28a(+)-AFP的酶切鉴定

2.2 重组蛋白pET28a(+)-AFP的诱导表达鉴定

挑取5个pET28a(+)-AFP/BL21(DE3)单菌落，以pET28a(+)/BL21(DE3)菌株作对照，在相同条件下(37 ℃，IPTG浓度为1 mmol/L，150 rpm诱导8 h)诱导表达，诱导后的菌液经超声破碎和离心，用适量的灭菌水对菌体沉淀重悬，SDS-PAGE电泳鉴定结果如图2所示，5个AFP重组单菌落在经过相同条件诱导后，在75 kDa处均出现诱导表达的蛋白条带，pET-28a(+)/BL21(DE3)菌株在此处没有出现相应的蛋白条带，未诱导对照组只是少量表达，此结果与预期计算的分子量大小一致，说明该重组菌可成功表达AFP重组蛋白。

M: 蛋白质分子质量标准；1：pET-28a(+)/BL21(DE3)空白组；2：1号菌诱导前；3：1号菌诱导后4: 2号菌诱导前；5：2号菌诱导后；6：3号菌诱导前；7：3号菌诱导后；8：4号菌诱导前；9：4号菌诱导后；10: 5号菌诱导前；11：5号菌诱导后图2 AFP重组蛋白的鉴定

2.3 pET28a(+)-AFP重组蛋白的最佳诱导条件的筛选

通过对诱导温度，诱导剂IPTG浓度，诱导时间的筛选，获得AFP重组蛋白大量表达的最佳诱导条件：30 ℃，0.1 mM IPTG，诱导8 h。

1) 设定IPTG浓度为1 mmol/L，在4个温度条件(16、25、30、37 ℃)中，150 r/min振荡诱导6 h。结果如图3所示，当诱导温度为30 ℃，AFP重组蛋白的表达量更高，故选择30 ℃为AFP重组蛋白的最佳诱导温度。

M: 蛋白质分子质量标准；1: pET-28a(+)/BL21(DE3)空白组；2: 未诱导对照；3:16 ℃诱导上清；4: 16 ℃诱导沉淀；5: 25 ℃诱导上清；6: 25 ℃诱导沉淀；7: 30 ℃诱导上清；8: 30 ℃诱导沉淀；9: 37 ℃诱导上清；10: 37 ℃诱导沉淀图3 重组蛋白AFP的最佳诱导温度筛选结果

2) 当诱导温度为30℃，设定5个IPTG浓度(0.1、0.3、0.5、0.75、1 mmol/L)，150 r/min振荡诱导6 h。结果如图4所示，当IPTG浓度为0.1 mmol/L，AFP重组蛋白的表达量更高，故选择0.1 mmol/L的IPTG为最佳诱导剂浓度。

M:蛋白质分子质量标准；1：未诱导对照；2：0.1 mmoL/L诱导上清；3：0.1 mmoL/L诱导沉淀；4：0.3 mmoL/L诱导上清；5： 0.3 mmoL/L诱导沉淀；6：0.5 mmoL/L诱导上清；7：0.5 mmoL/L诱导沉淀；8：0.75 mmoL/L诱导沉淀.9：0.75 mmoL/L诱导沉淀；10：1 mmoL/L诱导上清;11：1 mmoL/L诱导沉淀图4 重组蛋白AFP最佳诱导剂浓度筛选结果

3) 当诱导温度为30 ℃，IPTG浓度为0.1 mmol/L时，150 r/min振荡诱导2、4、6、8、10、12 h。结果如图5所示，当诱导时间为8 h或10 h时，AFP重组蛋白的表达量较高，综合确定最佳诱导时间为8 h。

M:蛋白质分子质量标准；1：2h诱导上清；2：2 h诱导沉淀；3：4 h诱导上清；4：4h诱导沉淀；5：6 h诱导上清；6：6 h诱导沉淀；7：8 h诱导上清；8：8 h诱导沉淀9：10 h诱导上清；10：10 h诱导沉淀；11：12 h诱导上清12：12 h诱导沉淀图5 重组蛋白AFP最佳诱导时间筛选结果

2.4 AFP重组蛋白的纯化

按照最佳诱导条件获得大量表达的AFP重组蛋白后，通过洗涤包涵体、溶解变性、纯化及蛋白复性，获得AFP重组蛋白。如图6所示，300 mM的咪唑可将AFP目的蛋白完全洗脱。收集280 nm紫外吸收峰下的AFP重组蛋白样品并进行SDS-PAGE电泳纯度鉴定，结果如图7所示，纯化后的AFP重组蛋白分子量与预期相符且纯度较高。