辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠的抗炎作用及其机制研究

刘 青, 孙伯坚, 任冬飞, 李 林, 杨智晖, 梁瑞凯

(1. 河北省第八人民医院 呼吸内科, 河北 石家庄, 050021;2. 河北医科大学第一医院 风湿免疫科, 河北 石家庄, 050000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种慢性气道疾病，不完全可逆的气流受限是其主要特征，可以导致患者慢性活动能力降低，甚至发展为永久性的不可逆损害，病死率高[1-2]。目前，研究[3-5]一致认为，气道慢性非特异性炎症是导致COPD发生发展的病理基础，炎性细胞及其细胞因子在发病期间起到了关键作用，这些因子包括基质金属蛋白酶家族成员、白细胞介素(IL)家族成员与肿瘤坏死细胞因子(TNF)家族成员等。《慢性阻塞性肺疾病全球防治创议》[6]在研究疾病治疗的方向中明确指出，控制COPD患者症状，抑制病情进一步发展是治疗的关键，但至今对于COPD仍无特效防治药物。他汀类药物主要用于治疗心血管疾病，调脂、预防动脉粥样硬化是目前临床对该药疗效的普遍认识，但近几年流行病学研究发现，他汀类药物能够缩短急性加重期COPD患者的住院时间，并降低病死率，可能的机制包括影响炎症介质和细胞黏附因子的释放、抗氧化作用、加速凋亡细胞清除等[7-9]。但目前关于他汀类药物治疗COPD价值的研究较少，具体作用机制尚不可知。本研究观察辛伐他汀用于COPD大鼠治疗的价值，探讨药物对疾病可能的抗炎机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物

选择雄性SD大鼠50只，均购自河北医科大学动物管理中心，大鼠均为清洁级，周龄为6～8周，平均(7.0±1.0)周; 体质量0.18～0.22 kg, 平均(0.20±0.02)kg。

1.2 主要药品、试剂

辛伐他汀购自北大医药股份有限公司(国药准字H20093359), 剂量20 mg/片; 10%水合氯醛购自青岛宇龙海藻有限公司; 脂多糖(LPS)由美国Sigma公司提供; 香烟由滁州烟卷厂生产，尼古丁1.2 mg, 焦油量19 mg; 炎性因子试剂盒由深圳达科为生物技术有限公司提供。

1.3 主要仪器设备

RSE3020型动物肺功能仪器、AniRes2005软件分析系统由北京贝兰博科技有限公司提供, JW-3021HR型高速台式离心机由安徽嘉文仪器装备提供，显微镜由日本OLYMPUS公司提供。

1.4 建模和分组方法

① 分组: 50只雄性SD大鼠进行适应性饲养7 d后，随机选择10只大鼠作为空白对照组，将剩下的40只大鼠建立COPD模型，建模成功后随机分为模型组、辛伐他汀组，其中辛伐他汀组根据剂量的不同，又分为低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只。② COPD大鼠模型建立[10]: 正确建立COPD大鼠模型。空白对照组给予1 mL/(100 g·d)的生理盐水灌胃，其他40只COPD模型大鼠同样给予等剂量生理盐水灌胃8周，灌胃第5周开始行COPD造模。辛伐他汀各组大鼠给予辛伐他汀(低剂量组: 5 mg/kg, 中剂量组: 10 mg/kg, 高剂量组: 15 mg/kg)灌胃, 1次/d, 灌胃时间仍为8周。全部大鼠除烟熏时间外，其他时间均在相同环境下饲养。建模成功后观察4周, 4周后处死大鼠。本研究中全部大鼠的处理均符合《医学实验课中实验动物伦理学要求的实施与思考》[11]中相关意见和规定。

1.5 观察指标

肺功能检测: 造模4周后，麻醉全部大鼠并将其固定，切开颈部皮肤，分离组织或暴露气管，将三通管气管插管插入，局部缝合固定，将气管插管一端连接动物呼吸机，检测最大肺活量(FVC)、第0.1秒用力呼气容积(FEV0.1)、最大呼气流速(PEF)。

检测支气管肺泡灌洗液中炎性因子水平。① 支气管肺泡灌洗液采集方法: 将肺功能检测结束但依然处于麻醉状态的大鼠胸腔打开，使用血管钳将左支气管结扎。经气管插管将3 mL生理盐水注入右肺, 20 s后回抽收集支气管肺泡灌洗液，反复进行3次，最终获取支气管肺泡灌洗液6 mL。将采集得到的支气管肺泡灌洗液经1 500 转/min离心15 min, 取上清液保存待检。② 检测方法: 白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-17(IL-17)、白细胞介素-32(IL-32)、肿瘤坏死细胞因子-α(TNF-α)等炎性因子水平均采用酶联免疫吸附法检测，严格按照说明书进行操作。

逆转录: 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测维甲酸相关孤儿受体(ROR-γt)mRNA表达量，使用TRIzol实际提取RNA, 逆转录互补脱氧核糖核酸，做聚合酶链反应(PCR)扩增。确定目的基因引物序列。使用20 g/L琼脂糖凝胶电泳比较ROR-γt与对照组相对吸光度值，行半定量分析，计算相对表达量。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 5组大鼠肺功能检查结果比较

与空白对照组比较, COPD模型大鼠肺功能指标水平均下降，差异有统计学意义(P<0.05); 高剂量组大鼠肺功能下降程度低于模型组、低剂量组、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05); 低剂量组与中剂量组各肺功能指标水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 5组大鼠肺功能检查结果比较

2.2 5组大鼠支气管肺泡灌洗液中性因子水平比较

与空白对照组比较, COPD模型大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α含量增加，差异有统计学意义(P<0.05); 高剂量组大鼠各支气管肺泡灌洗液中炎性因子含量低于模型组、低剂量组、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05); 低剂量组与中剂量组支气管肺泡灌洗液中炎性因子水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 5组大鼠支气管肺泡灌洗液炎性因子水平比较 ng/L

2.3 5组大鼠ROR-γt mRNA表达量比较

与空白对照组比较, COPD模型大鼠ROR-γt mRNA相对表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05); 高剂量组大鼠ROR-γt mRNA相对表达量低于模型组、低剂量组、中剂量组，差异有统计学意义(P<0.05); 低剂量组与中剂量组ROR-γt mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 5组大鼠ROR-γt mRNA表达量比较

3 讨 论

COPD是一种以肺实质、气流受限、全身炎症为主要特征的慢性疾病，被认为是炎症反应的失调状态，以气道炎症、肺部炎症及系统性多器官损害为主要表现[12]。COPD患者无论是气道炎症还是全身炎症反应，其发生机制均较复杂，炎症反应过程都有大量细胞因子、趋化因子及其他介质参与[13], 可见疾病治疗期间抑炎、抗炎具有重要意义。

临床多认为，吸烟是COPD的独立危险因素，长时间、大量吸烟会导致肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞及其他主要炎症细胞活化，释放出大量细胞因子及趋化因子，包括IL-6、IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α等，这些主要的炎症因子在COPD炎症反应发生、发展期间具有重要作用[14-15]。研究[16]发现，稳定期COPD患者痰液内IL-18、TNF-α等炎症因子水平升高，随着疾病进展至急性加重期，患者上述各炎症因子水平显著升高，且高于稳定期。IL-8、IL-17、IL-32、TNF-α均是重要的促炎细胞因子，其中IL-8通过肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞等释放，是主要的中性粒细胞趋化因子，在COPD患者肺内呈高表达，可以对中性粒细胞诱导的炎症反应产生激活作用[17]。IL-17主要来源于CD4+T淋巴细胞因子的Th17细胞，经特异性转录因子ROR-γt编码产生效应因子，该因子的生物活性广泛，不仅能够招募巨噬细胞与中性粒细胞，还能促基质金属蛋白-9产生。此外, IL-17还对支气管上皮细胞中气道黏液黏蛋白的产生有影响，参与慢性炎症反应的进程[18-19]。IL-32主要通过T细胞、上皮细胞等合成分泌，是一种编码炎症性细胞因子，可经激活各主要磷酸化途径来诱导其他细胞因子及趋化因子的产生，参加炎症反应的发生过程。此外, IL-32还能诱导单核细胞转化为巨噬细胞，增强多形核粒细胞的杀伤力与吞噬功能，参与COPD特异性免疫应答与炎症反应，进一步推动COPD病情的进展[20]。TNF-α是早期炎症引发因子，能够激活内皮细胞，直接刺激黏附因子的相对表达，诱导中性粒细胞迁移，并释放IL-8, 白细胞趋化作用极强。同时, TNF-α还能促进中性粒细胞功能的增强，促中性粒细胞脱颗粒，合成并分泌出更多的TNF-α, 进一步加重炎症程度，加快COPD病情进展[21]。本研究结果显示, COPD模型大鼠肺功能较空白对照组降低，各炎症因子水平较空白对照组升高，且ROR-γt mRNA相对表达量也升高，与王戈[22]研究结果一致，说明炎症反应贯穿了COPD疾病发生、发展的过程。因此早期给予COPD患者合理的抗炎药物治疗，帮助患者减轻全身炎症反应，可能对增强疗效有一定价值。

他汀类药物作为一类3-羟-3-甲基-戊二酰辅酶还原酶抑制剂，被广泛用于心血管疾病并发症的预防及胆固醇降低的治疗。研究[23]发现，他汀类药物不仅具有理想的调脂作用，还具有强大的“外周效应”，如抗炎症介质、抗炎症细胞因子、抗氧化、抑制黏附分子表达、免疫调节等。他汀类药物具有的这些“外周效能”可能是降低COPD患者病死率与住院率的基础，但药物治疗COPD有效性与安全性及相关机制的研究国内并不多见。为进一步观察他汀类药物治疗COPD是否能获得理想效果，本研究成功建立了COPD大鼠模型，结果显示，辛伐他汀治疗的大鼠肺功能优于模型组，各主要促炎因子水平和ROR-γt mRNA相对表达量低于模型组，高剂量辛伐他汀的应用带来的改善效果最为理想，而低剂量与中剂量比较，差异无统计学意义(P>0.05), 提示辛伐他汀用于COPD的治疗可能有一定抗炎效果。辛伐他汀除有降脂作用外，还具有潜在的多效性，包括抗炎、改善血管内皮功能等作用，使用药物后可通过抑制甲羟戊酸途径中止Rho的活化，从而抑制并减少类异戊二烯化产物的合成，最终减少诸多前炎症细胞因子的合成与释放，如IL-6、IL-8、TNF-α等[24]。王燕等[25]研究发现，辛伐他汀能够减轻COPD大鼠肺部炎症介质的释放，减轻气道炎症与肺气肿程度，阻止大鼠气道内阻力进一步增加，与本研究辛伐他汀的抗炎效果一致，进一步说明辛伐他汀在COPD中的应用价值。既往相关研究[26-27]发现，阿托伐他汀对炎症的调节作用主要通过Toll样受体、炎性体、小G蛋白、mircoRNA小分子非编码单链RNA、过氧化体增殖物激活型受体等途径实现，其中Toll样受体已被证实在阿托伐他汀调控炎症反应过程中扮演重要角色，这类受体主要经髓样分化因子88信号通路激活核因子κB, 从而启动炎性因子的释放，而阿托伐他汀在使用后可以抑制Toll样受体的表达，抑制这些相关受体的敏感性，并通过抑制外周血单个核细胞Toll样受体的表达减少炎性因子的分泌，促进相关蛋白表达的下调，从而发挥抗炎作用。但值得注意的是，目前关于阿托伐他汀的抗炎机制仍处于研究阶段，且相关研究较少，尚无较多循证学依据作为支持，故本研究所得的结果真实、可靠，均需要在未来开展前瞻性、大样本的研究加以验证。

综上所述，辛伐他汀能够通过抑制COPD大鼠肺组织ROR-γt的表达，从而抑制大鼠肺部炎症进一步发展，降低各炎症因子的表达，促进肺功能改善。