血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化在肺癌筛查中的意义

初 霞，王保健，赵 伟，赵 坡

随着精准诊断和治疗的发展，越来越多的肺癌患者从中获益，延长了生命，但是肺癌仍位于肿瘤死亡的第一位［1］。因此，肺癌的早期诊断和治疗是解决上述问题的关键。既往研究显示检测血浆游离DNA（cfDNA）中 的SHOX2（short stature homeobox 2，SHOX2）和PTGER4（prostaglandin E receptor 4 gene，PTGER4）基因甲基化有助于CT肺结节性质的提示，在恶性肺结节中甲基化阳性率高达90%［2］。本研究分析肺癌与非肺癌中两基因甲基化情况，以及甲基化与临床病理特征的关系，探讨其在肺癌早期筛查的意义。

1 对象与方法

1.1 对象 选取联勤保障部队第九八八医院2018年1月～2019年4月检测者共176例，男性121例，女性55例，年龄28～93岁，平均年龄58岁。肺癌组93例，其中鳞癌34例，腺癌41例，小细胞癌17例，大细胞神经内分泌癌1例；TNM分期，Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期25例，Ⅳ期33例。对照组中非恶性肺部疾病有73例，包括肺炎或支气管炎患者67例，肺结核2例，间质性肺炎4例，健康体检者10例。所有患者均在自愿的前提下，签订知情同意书。本研究遵从修订版的赫尔辛基宣言，得到医院伦理委员会的认可。

纳入标准：肺癌组均经病理组织学确诊为肺癌，按WHO2015版组织学分类，按国际抗癌联盟（UICC）第8版肺癌分期标准进行分期，所有患者采样前均未接受抗肿瘤治疗，也未患有其他肿瘤。

1.2 方法 晨起空腹采集10 ml静脉血于streck管（上海菱格生物科技有限公司）内，以离心半径8.5 cm、1 500 r/min离心10 min，移取血浆于2.0 ml EP管中，再以离心半径8.5 cm、16 000 r/min，低温（2～8℃）离心10 min，抽取上清于新的2.0 ml EP管中。应用商业化磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司（DP710）］提取血浆cfDNA，用Qubit 4.0超微量分光光度计（Thermo）检测DNA浓度，用重亚硫酸盐转化试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司（DP215）］对DNA进行亚硫酸盐修饰，采用ABI7500实时荧光定量PCR仪扩增（Thermo），实验设计和原理参考文献［3］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司制备，PCR反应条件为94℃、20 min，50个循环（94℃、15 s，64℃、5 s，60℃、30 s），25℃、1 min。每个样本重复3次（表1）。

表1 SHOX2、PTGER4和GAPDH引物序列

1.3 结果判读 靶基因SHOX2和PTGER4通道显示的数据是与内对照GAPDH相比较得出的相对数值，有S型扩增曲线且Ct值≤50，根据设定的阈值，将6个有效的Ct值输入专用的判读软件进行分析，得出SHOX2和PTGER4基因甲基化情况。该样本的最终判读是根据软件计算得出，6个单独的Ct结果均不能代表样本最终的结果。阳性表示检测到SHOX2和/或PTGER4基因发生甲基化，阴性表示没有检测出SHOX2和PTGER4基因甲基化。

1.4 病理检查 所有送检至病理科的组织学标本，均经100 ml/L中性甲醛固定6～24 h后，取材、脱水、石蜡包埋、切片、常规HE染色后，光学显微镜下进行HE诊断，如有需要再进行免疫组化染色协助诊断。在澳大利亚Leica Bond-Max自动免疫组织化学染色仪上用En VisionTM方法染色，所有一抗均为上海杰浩即用型试剂，包括CK5/6、P63、CK7、TTF-1、NapsinA、CD56、CgA、Syn、Ki-67，修复方法参考试剂说明书，其余试剂均为英国Leica公司。阳性细胞为胞膜或胞核含棕黄色颗粒者。肺鳞状细胞癌时CK5/6、P63阳性，阳性部位分别位于细胞膜和细胞核。肺腺癌时CK7、TTF-1、NapsinA阳性，分别位于细胞膜、核和膜。肺小细胞癌时CD56细胞膜强阳性、CgA、Syn阳性或阴性。肺大细胞神经内分泌癌时鳞、腺的标记为阴性，但是CD56阳性。Ki-67细胞核阳性，提示肿瘤的增殖活性，小细胞癌常大于90%。超过80%的肿瘤细胞着色即认为是阳性。用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.5 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件，采用卡方检验比较肺癌组和对照组甲基化；肺癌组甲基化与患者临床特征关系；肺炎/支气管炎组甲基化与患者临床特征的关系。运用Spearman相关性分析肺炎/支气管炎组中肺纤维化或胸膜增厚与甲基化的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 所有标本血浆cfDNA的SHOX2和PTGER4基因甲基化情况 176例样本检测结果绘制ROC曲线，AUC面积为0.788，检测肺癌的灵敏性和特异性分别是74%和85.1%。肺癌组甲基化阳性率为83.9%（78/93），明显高于对照组28.9%（24/83），差异有统计学意义。对照组中肺炎/支气管炎阳性率32.9%（22/67）、肺结核0、间质性肺炎50%（2/4）和健康体检者0。肺癌组和对照组间差异有统计学意义（χ2=59.628，P＜0.05，表2）。

表2 两组标本甲基化［例（%）］

2.2 肺癌组基因甲基化与临床病理特征关系 肺癌组血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化与患者的性别、年龄、吸烟史无关（P>0.05）。与病理类型有关，不同病理类型间差异有统计学意义（P＜0.05）。鳞状细胞癌、大细胞神经内分泌癌阳性率100%（34/34），小细胞癌82.4%（14/17），腺癌70.7%（29/41），不同TNM分期间差异有统计学意义（P＜0.05）。早期肺癌（Ⅰ和Ⅱ期）甲基化阳性率为68.6%（24/35），Ⅳ期为93.9%（31/33），分期越高阳性率越高（表3）。

表3 93例肺癌患者甲基化与临床特征的关系［例（%）］

2.3 肺炎/支气管炎组基因甲基化与临床特征 肺炎/支气管炎组血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化阳性率为32.8%（22/67），与患者的性别、年龄、吸烟史无关（P>0.05，表4）。

表4 67例肺炎/支气管炎患者甲基化与临床特征的关系［例（%）］

2.4 肺炎/支气管炎组中肺纤维化和胸膜增厚与基因甲基化相关性 肺炎/支气管炎组中血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化阳性的患者，部分伴有肺纤维化或胸膜增厚，但统计学显示肺纤维化和胸膜增厚与甲基化之间并无相关性（Spearman相关系数ρ=0.029，P=0.863）。

3 讨论

当前肺癌的早期筛查方法有低剂量螺旋CT、肺癌特异性血清肿瘤标志物等。研究显示，与胸部X射线相比，CT组肺癌相关死亡率降低了20%，但其假阳性率也很高，在NLST研究中，假阳性结节比例高达96.4%［4］。血清肿瘤标志物联合检测虽提高了敏感性，但特异性降低，而且很多早期肺癌血清标志物正常［5］。DNA异常甲基化出现于细胞癌变的早期，发生在CpG岛（CpG islands，CGIs）上，发生于转录起始处的CGIs，导致抑癌基因沉默，而发生于基因体内CGIs，促进转录延长［6］。目前通过检测粪便内BMP3和NDRG4基因甲基化以及血浆中Septin9基因甲基化，用于大肠癌的早期筛查［7］。研究发现早期肺癌中存在多个基因的异常甲基化，部分 基 因 的 甲 基 化 还 与 肺 癌 的 预 后、进 展 有 关［6，8-9］。多项研究证明肺癌组织中存在SHOX2基因甲基化，其在肺癌患者不同类型标本中的阳性率为35.7%～74.3%［10-11］。夏冬 平 等［12］和 王南等［13］对 肺癌患者血浆SHOX2基因甲基化的检测，提示它可作为一种非侵入性的肺癌肿瘤标志物。Anne等［14］运用三重实时荧光定量PCR检测肺癌患者血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化，特异度95%时，灵敏度为67%，优登指数62%。Weiss等［7］用实时荧光定量PCR检测肺癌与非肺癌组中血浆多个基因甲基化情况，最后得出SHOX2/PTGER4基因甲基化是最优组合，其优登指数近60%。本研究的灵敏度和特异度分别是74%、85.1%，优登指数为59.1%，与他们接近。Yin等［3］通过荧光定量PCR检测493例Tis0-I期肺癌患者血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化，结果338例（68.6%）有异常甲基化。本研究检测显示肺癌患者血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化在早期肺癌（Ⅰ和Ⅱ期）中阳性率达到68.6%（24/35），在Ⅳ期为93.9%（31/33）。这些提示血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化可用于肺癌的无创筛查。

研究显示，非小细胞肺癌CGI的高度甲基化与组织学类型和进展有关［15-16］。本研究也证实了这点，鳞状细胞癌和大细胞神经内分泌癌的SHOX2和PTGER4基因甲基化阳性率达到100%，小细胞癌、腺癌分别为82.4%和70.7%；TNMⅠ期阳性率71.4%，Ⅳ期93.9%，分期越高，基因甲基化阳性率越高，可能与晚期肿瘤细胞增生活跃、体循环中样本DNA含量较高，因而甲基化基因拷贝数增加有关［17］。

本研究显示肺炎/支气管炎组血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化阳性率达到32.9%。部分阳性患者的CT提示有一处或多处纤维化，或胸膜局限性增厚。慢性炎症的长期存在，致使多种致炎因子反复、持续刺激肺泡上皮，致其损伤、脱落和增生修复，若不及时干预，可出现不典型增生、癌变，同时反复发生上皮损伤的部位会出现纤维母细胞的迁移、增殖、分化和抗凋亡能力增强［18］。Li等［19］分析提示肺纤维化患者中肺癌的发生率为4.8%～48%，远远高于无肺纤维化的患者（2.0%～6.4%）；Goto等［20］发现肺纤维化合并肺癌的发病率在美国为4.8%～8.0%，日本为48.2%，韩国为13.1%，均提示肺纤维化与肺癌的发生有一定关系。Ma等［21］在暴露于二氧化钛微粒下的幼年小鼠肺中发现有炎症基因（IFN-γ和TNF-α）和组织纤维化基因（Thy-1）的启动子甲基化。本研究4例间质性肺炎患者，2例基因甲基化检测阳性。间质性肺炎的镜下特征也存在成纤维细胞增生、纤维化伴有炎细胞浸润。尽管统计学提示肺纤维化和胸膜增厚与甲基化无相关性，但是数据中的确出现伴有肺纤维化或胸膜增厚患者的甲基化阳性，SHOX2和PTGER4基因甲基化是否也参与肺炎和纤维化，还有待于进一步探讨。血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化阳性的肺炎/支气管炎患者应该结合影像学和其他临床特征综合判定，是否需要随访还有待于追踪判断。

血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化检测可以作为一种无创检测，辅助鉴别诊断肺癌与非肺癌患者，用于目前筛查方法的补充。对于临床病史、体征或CT提示，有增加肺癌风险的患者，最终有可能受益于血浆SHOX2和PTGER4基因甲基化检测。