勿动蛋白与Rho相关蛋白激酶对心脏交感神经重塑与去甲肾上腺素转运蛋白表达的调节
2021-11-05李世军王晓娜
李世军,李 昂,张 璐,王晓娜
心肌肥厚和心肌组织纤维化是心力衰竭的主要病理环节,高血压左室肥厚向心力衰竭发展的决定因素是心肌胶原的过度沉积,即心肌纤维化,防止或逆转心肌纤维化可能有助于维护心脏功能。交感神经系统过度活化在心肌肥厚、心肌纤维化过程中发挥重要作用。交感神经系统亢进在高血压心肌肥厚的形成中极其重要,神经内分泌系统的激活可诱发心室重构。研究显示,心脏交感神经切除减缓自发性高血压大鼠心肌肥厚与心肌纤维化[1];勿动蛋白(Nogo)A-RhoA/Rho相关蛋白激酶(ROCK)信号通路参与自发性高血压大鼠心肌肥厚与纤维化的调节[2]。勿动蛋白(Nogo)A是髓鞘相关轴突生长抑制蛋白,抑制神经细胞的迁移和扩散,NogoA通过与Nogo受体结合,激活RhoA及其效应子Rho相关蛋白激酶(ROCK),抑制轴突生长。ROCK抑制剂法舒地尔上调肾上腺髓质细胞Ca2+依赖性或诺考达唑敏感途径的去甲肾上腺素转运蛋白(NET)功能[3]。本研究拟探讨Nogo与ROCK对心脏交感神经重塑与NET表达的调节作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料和实验动物 胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胰蛋白酶购自美国Sigma公司;DMEM F-12(1∶1)、胎 牛 血 清、B-27supplement、antibiotic antimycotic购自美国Gibco公司;去甲肾上腺素购自美国J&K公司、Nogo-66购自美国BIOSS公司、去甲肾上腺素转运蛋白抑制剂(Edivoxetine)购自美国AdooQ公司、选择性的Rho抑制剂(Fasudil)与ROCK特异性抑制剂(Y-27632)购自美国Selleck公司、酪氨酸羟化酶(TH)抗体购自英国Abcam公司、去甲肾上腺素ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限(CUSABIO BIOTECH)公司。出生后1~3 d龄SD乳鼠36只,购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证编号:SYXK(京)2017-0022)。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞分离培养 SD乳鼠在75%酒精中浸泡后,开胸取出心室肌,用无血清DMEM培养基清洗3~4次。将心脏用眼科尖剪剪成约1 mm大小的碎块,用分次消化法将心肌碎块用0.25%胰蛋白酶消化成心肌细胞悬液,每次消化10 min,将每次消化得到的心肌细胞悬液用200目的尼龙网滤去细胞团块。将上述细胞悬液离心后用培养液稀释成细胞密度约2×105个/ml,然后将其种植于小培养瓶内,放入37℃、5%CO2培养箱内孵育2~3 h,以使成纤维细胞贴壁,将悬浮细胞液转染至新的细胞培养皿内,37℃5%CO2条件下继续培养。在种植心肌细胞之前,每个小培养皿内预先放置一个涂有鼠尾胶的直径为24 mm的圆盖片,将这些标本放入37℃、5%CO2培养箱内孵育72或96 h,中间48 h更换1次培养液。用作联合培养的心肌细胞培养的悬液留待后用。
1.2.2 脊髓背根神经元细胞分离培养 出生3 d内的SD大鼠,用2%戊巴比妥钠麻醉(30 mg/kg,ip)后,在无菌条件取双侧脊髓胸腰段背根神经节,放入盛有4℃无血清DMEM/F12培养基液的平皿中,眼科剪将神经节剪至0.5 mm3大小的组织块,并用无血清DMEM/F12培养基冲洗3遍。将组织块移入加有0.25%胰蛋白酶的离心管中,37°C培养箱中消化20 min。加入胎牛血清终止消化并吹打,200目滤网过滤。细胞悬液以离心半径19.0 cm、1 000 r/min离心10 min,弃上清。用DMEM-F12重悬细胞,并接种入培养皿内,差速贴壁50 min。小心收集细胞悬液,再次以离心半径19.0 cm、1 000 r/min离心10 min。用神经元细胞完全培养基重悬(含1%胎牛血清,2%B27添加剂和2 mmol/L谷氨酞胺的NeuralBasal培养基)重悬细胞,对细胞进行计数,调整细胞密度为5×105个/ml。接种于预先以多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的细胞培养皿中,在37℃5%CO2条件下培养24 h后更换含5-氟鸟嘧啶的神经元细胞培养基,继续培养。
1.2.3 细胞鉴定-免疫荧光 待细胞生长至80%以上时,常规胰酶消化终止后,按5×105个/ml的量将细胞铺于24孔细胞培养板内。24 h后,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次。用4%多聚甲醛室温固定细胞10 min。PBS洗涤3次,加入1∶200稀释的cTnT抗体(用于心肌细胞鉴定)和Nestin抗体(用于神经元细胞鉴定),4℃过夜反应。PBS洗涤3次×5 min,加入1:200稀释的Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor 488),室温避光反应45 min。PBS洗涤3次,加入DAPi工作液,避光反应15 min。PBS洗涤10次×5 min后,在倒置荧光显微镜下进行观察拍照。
1.2.4 细胞模型 细胞按常规消化终止后用生长培养基调整细胞密度为1×105个/ml,其中后续用于共聚焦检测的细胞铺于共聚焦培养皿内,150μl/皿;用于实验的细胞铺于6孔细胞培养板内,1.5 ml/皿;24 h后分为4组:A组(心肌细胞+交感神经节细胞);B组(心肌细胞+交感神经节细胞+Nogo-66);C组(心肌细胞+交感神经节细胞+C3转移酶+Nogo-66);D组(心肌细胞+交感神经节细胞+Y-2763+Nogo-66)。
1.2.5 免疫荧光 细胞模型结束后,弃掉细胞原培养基,加入150μl细胞固定剂,室温固定15 min;用PBS洗涤2次;加入1∶200稀释的去甲肾上腺素转运蛋白或酪氨酸羟化酶抗体,4℃过夜反应;用PBS洗涤3次;PBS洗涤3次×5 min,加入1∶200稀释的Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor 488),室温避光反应45 min;PBS洗涤3次,加入DAPi工作液,室温避光反应15 min;PBS洗涤10次×5 min后,在倒置荧光显微镜下进行观察拍照;通过Image J软件分析目的蛋白荧光强度。
1.2.6 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 蛋白浓度调整:用样品稀释液调整待测样品蛋白浓度为1 mg/ml,试剂盒平衡室温后使用。设置标准品孔、待测样品孔、空白孔。标准品,50μl/孔,去甲肾上腺素(NE)120、80、40、20、10、0 ng/L。待测样品10μl/孔,同时加入40μl样品稀释液。直接加入100μl/孔标记抗体工作液,37℃反应1 h。用洗涤液洗涤酶标板3次,拍干。加TMB显色液,100μl/孔,37℃避光反应15~30 min,加终止液,50μl/孔。450 nm下读取吸光值(A),以标准品浓度和吸光值绘制标准曲线,通过标准曲线计算样品中NE。
1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件进行数据分析,计量资料以(±s)表示,多组之间的均数比较用单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni post-hoc检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组免疫荧光染色检测TH表达 免疫荧光染色结果显示,与A组(1.00±0.00)比较,B组(0.07±0.01)交感神经节酪氨酸羟化酶(TH)表达明显降低,C组(1.99±0.55)与D组(2.13±0.72)TH表达明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05,图1)。
图1 免疫荧光染色检测TH表达(×200)
2.2 各组培养液中去甲肾上腺素含量 ELISA检测结果显示,与A组(117.34±2.47)ng/L比较,B组[(94.32±7.34)ng/L]去甲肾上腺素含量明显降低,C组[(124.61±2.97)ng/L)与D组[(127.19±3.54)ng/L)去甲肾上腺素含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 各组NET表达 免疫荧光染色结果显示,与A组(1.00±0.00)比较,B组(0.07±0.01)TH表达明显降低,C组(1.99±0.55)与D组(2.13±0.72)TH表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05,图2)。
图2 免疫荧光染色检测NET表达(×200)
3 讨论
高血压心肌肥厚时存在交感神经兴奋性增高,心肌去甲肾上腺素含量增高,心肌去甲肾上腺素含量增高(即心脏交感神经功能重构)与心脏交感神经密度降低(即心脏交感神经结构重构)显著负相关,心脏交感神经分布与兴奋性异常与高血压心肌肥厚密切相关[1]。但是,心肌去甲肾上腺素含量长期处于较高浓度会引起神经生长因子减少,导致心脏交感神经纤维密度减低,出现心脏交感神经重塑[5]。可见,调控心肌去甲肾上腺素含量是干预心肌肥厚的核心环节。心脏交感神经突触前膜上的去甲肾上腺素转运蛋白(NET)是控制心肌间质中去甲肾上腺素浓度的最重要因子[4-6]。全身交感神经释放的去甲肾上腺素绝大部分通过位于肾上腺素能神经突触前膜NET再摄取回突触前膜内,NET对调控突触间隙中的NE浓度、终止神经冲动信号、维持受体对神经递质的敏感性极为重要[7]。然而,高血压心肌肥厚时心脏交感神经重塑与NET表达调节的上游信号转导机制还不完全清楚。
神经元轴突生长抑制因子Nogo有3种同源异构体:Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C[8]。Nogo受体(Nogo protein receptor,NgR)是由结构相关的分子NgR1、NgR2和NgR3构成的蛋白质家族[9]。NgR定位于脊髓、眼和横纹肌(包括心脏),并认为在生物演变过程中,Nogo和NgR的表达和其保守性支持Nogo信号是神经系统和横纹肌(包括心脏)发育的一个关键通路[10]。Nogo可通过激活NgR的复合受体(由NgR、p75NTR和Lingo-1组成)激活小鸟嘌呤核苷三磷酸酶(small GTPases)的Rho家族成员(rho、rac1、cdc42)及内源性第二信使。Rho蛋白家族是真核细胞内一类重要的信号转导分子,是许多膜表面受体如G蛋白耦联受体、酪氨酸激酶受体、细胞因子受体和黏附分子受体的下游效应蛋白,在细胞信号转导过程中发挥着“分子开关”的作用,快速转换于GTP结合的活化状态和GDP结合的非活化状态之间,将细胞外信号传至细胞内。Rho A与其下游效应蛋白Rho激酶(Rho kinase,ROCK)参与调节肌动蛋白细胞骨架和粘着斑/应力纤维形成,在交感神经系统多种功能调节中发挥重要作用。Rho激酶(Rho kinase,ROCK)抑制剂(Fasudil)降低自发性高血压大鼠肾上腺髓质交感神经活性,降低血浆儿茶酚胺、肾上腺髓质酪氨酸羟化酶蛋白和mRNA水平。本研究Nogo抑制交感神经节细胞生长与去甲肾上腺素的释放;阻断RhoA/ROCK信号通路后,Nogo对交感神经节细胞生长与去甲肾上腺素释放的抑制作用消失。提示,Nogo介导ROCK参与交感神经节细胞生长与去甲肾上腺素释放的调节。
RhoA/ROCK信号通路参与视网膜神经节细胞轴突生长的调节。ROCK抑制剂(Fasudil)能够通过肾上腺髓质细胞Ca2+依赖性的和或诺考达唑(nocodazole)敏感途径上调NET的再摄取功能[11]。Rho/ROCK信号通路激活也可以导致快速的生长锥萎陷,从而使神经元轴突损伤后很难再生[12]。因此,推测RhoA/ROCK信号通路极可能通过调节心脏交感神经重塑与NET表达参与高血压心肌肥厚的调节。以往的研究提示,高血压心肌肥厚患者心脏交感神经分布减低,心脏神经元轴突生长抑制因子Nogo-A表达增加,心脏交感神经分布减低与Nogo-A表达增加呈显著负相关。本研究进一步证明,Nogo抑制NET的表达;阻断RhoA/ROCK信号通路后,Nogo对NET的抑制作用消失。提示,Nogo与ROCK参与心脏交感神经重塑及NET表达的调节。