LINC01207在胃癌表达的意义以及其对胃癌增殖、迁移和侵袭的影响

王 星，吴付兵，陈国强，吴佳伦，左杨斌

胃癌是一个全球性的健康问题，每年全世界有100多万人被诊断为新的胃癌患者，亚洲国家胃癌的发病率和死亡率逐年上升，特别是在东亚国家［1-2］。由于胃癌早期不具有特异性的症状，大多数患者在首次诊断时已经处于中晚期，导致胃癌患者的预后较差［3］。尽管在过去的几十年里，胃癌的治疗取得了很大进展。然而，目前关于胃癌的恶性进展机制尚有许多未知。长链非编码RNA（LncRNA）参与多种疾病以及肿瘤的发生、发展过程［4-5］。基因间长链非编码RNA 01207（LINC01207）是长链非编码RNA中的一种。研究发现LINC01207对胰腺癌、肺腺癌和恶性胶质瘤的增殖和转移等具有重要的调控作用［6-8］。但其在胃癌中的表达及对胃癌细胞生物学行为的影响仍不明确。因此，本研究通过分析LINC01207在胃癌中的表达意义以及其对胃癌细胞生物学功能的作用，以期为胃癌临床治疗提供新的靶点。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2018年6月～2020年3月在联勤保障部队第九〇〇医院莆田医疗区100例被确诊为原发性胃癌并施行胃癌切除术患者的胃癌组织及癌旁组织（≥4 cm），其中女性47例，男性53例，所有患者术前均未接受放疗或化疗。患者的诊断和临床病理特征包括年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴转移和静脉血清中CEA水平、CA19-9水平、CA724水平均经过两位以上病理学和检验医生确认。所有患者术前均知情并签署同意书。手术切除后，所有标本做好标记并立即在液氮中储存直到用于后续RNA提取实验。

1.2 qRT-PCR检测LINC01207的表达 组织或细胞中的总RNA用Trizol试剂（Invitrogen，美国）提取，采用PrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa）将总RNA反转录成cDNA。PCR反应采用ABI 7500定量PCR仪和SYBR premix Ex TaqTM II Kit（TaKaRa，日本）定量检测组织或细胞中LINC01207的表达。以U6作为内参，用2-ΔΔCt法表示LINC01207在组织或细胞中的相对表达水平。

1.3 细胞培养和转染 人胃癌细胞MGC-803和BGC-823以及人胃黏膜正常细胞株GES-1（上海生命科学研究院细胞资源中心）采用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青-链霉素的DMEM培养液（Gibco，美国）培养，细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。MGC-803和BGC-823细胞中靶向LINC01207的siRNA（si-LINC01207）和阴性对照siRNA（si-NC）序列（上海吉玛制药）转染按照Lipofectamine 2 000转染试剂（Invitrogen，美国）说明书进行操作。细胞分为无处理组、对照组和干扰组。转染24 h后，收集细胞参照qRT-PCR方法检测转染效率。

1.4 Transwell实验检测LINC01207对胃癌细胞迁移和侵袭的影响 胃癌细胞增殖按CCK-8试剂盒（上海碧云天）进行操作。迁移实验：将转染后各组细胞按4 000个/100μl无血清培养基/孔接种于Transwell小室上室，下室加入800μl含10%胎牛血清（FBS）的血清培养基。培养48 h后，将Tanswell上室取出，用4%多聚甲醛溶液对小室膜下面的细胞进行固定，然后用0.1%结晶紫染色，湿棉签小心擦掉上室内膜表面的细胞。显微镜（OLYMPUS）下拍照并计数。侵袭实验：在小室的内部膜一预先铺上一层Matrige基质胶，Matrigel基质胶按照说明书进行配制和处理，其余同迁移实验。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据通过正态分布检验后复合正态分布的数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析后两组比较采用Tukey's检验。LINC01207表达在胃癌中的诊断意义采用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析。两组间比较采用独立t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC01207在胃癌组织中的表达 qRT-PCR结果显示，与正常组织（1.64±0.620）相比，胃癌组织中的LINC01207相对表达水平（5.12±2.239）显著上调，差异有统计学意义（t=14.99，P＜0.001）。

2.2 LINC01207的表达与胃癌患者临床病理特征的关系 组织中LINC01207表达水平与胃癌患者年龄、性别和分化程度之间没有明显的相关性，但与肿瘤大小、淋巴转移、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平呈显著相关性（表1）。

表1 LINC01207在胃癌患者中的表达与临床病理特征的关系（±s）

表1 LINC01207在胃癌患者中的表达与临床病理特征的关系（±s）

临床特征 例数 LINC01207表达 t值 P值年龄 0.948 0.345＜55 26 5.48±2.136≥55 74 5.00±2.271性别 0.337 0.737女34 5.23±2.078男66 5.07±2.331分化程度 1.137 0.258中和高分化 33 4.76±2.241低分化 67 5.303±2.333肿瘤大小 4.278 ＜0.001≥5 cm 47 4.81±2.036＜5 cm 53 5.96±2.092淋巴转移 3.161 0.002否32 4.14±2.258是68 5.59±2.089 TNM分期 3.375 0.001 I+II 40 4.24±2.034 III+IV 60 5.71±2.191 CEA水平 5.022 ＜0.001正常（＜10μg/L） 27 3.47±1.904高（≥10μg/L） 73 5.74±2.043 CA19-9水平 5.178 ＜0.001正常（＜35kU/L） 35 3.72±1.951高（≥35kU/L） 65 5..88±2.017 CA724水平 5.085 ＜0.001正常（＜8.2kU/L） 23 3.26±2.134高（≥8.2kU/L） 77 5.68±1.962

2.3 ROC曲线分析 ROC曲线分析表明曲线下面积为0.902（95%CI：0.859～0.957）。当胃组织中LINC01207表达水平的截断值为2.975时，灵敏度为84.0%，特异性为100.0%。

2.4 LINC01207在胃癌细胞中表达 与GES-1细胞（1.00±0.080）相比，MGC-803和BGC-823细胞中的LINC01207相对表达水平（4.23±0.470；5.53±0.437）显著升高，差异有统计学意义 （t=13.54，17.68，P＜0.001）。

2.5 干扰对胃癌细胞中LINC01207表达的影响MGC-803和BGC-823细胞经转染24 h后，qRTPCR结果显示3组之间LINC01207表达差异显著（P＜0.001）。与对照相比，干扰后MGC-803和BGC-823细胞中LINC01207相对表达水平均显著下调，差异有统计学意义（P＜0.001，表2）。

表2 转染si-LINC01207后MGC-803和BGC-823细胞中LINC01207相对表达（±s）

表2 转染si-LINC01207后MGC-803和BGC-823细胞中LINC01207相对表达（±s）

项目 无处理组 对照组 干扰组 F值 P值MGC-803 1.01±0.060 0.98±0.073 0.32±0.008 185.5 ＜0.001 BGC-823 1.00±0.025 1.02±0.023 0.29±0.025 864.5 ＜0.001

2.6 干扰LINC01207表达对胃癌细胞增殖的影响干扰的MGC-803和BGC-823细胞培养24 h后，3组间增殖率比较，差异有统计学意义（P＜0.001）。与对照组的细胞增殖率相比，干扰组胃癌MGC-803和BGC-823细胞增殖率显著降低，细胞生长明显受到抑制，差异有统计学意义（P＜0.001，表3）。

表3 干扰LINC01207表达对MGC-803和BGC-823细胞增殖率的影响（±s）

表3 干扰LINC01207表达对MGC-803和BGC-823细胞增殖率的影响（±s）

项目 无处理组 对照组 干扰组 F值 P值MGC-803 1.00±0.032 0.99±0.045 0.73±0.056 68.46 ＜0.001 BGC-823 1.00±0.052 1.03±0.033 0.78±0.033 63.44 ＜0.001

2.7 干扰LINC01207表达对胃癌细胞迁移和侵袭的影响 3组间迁移和侵袭细胞差异显著，差异有统计学意义（P＜0.001）。与对照组平均迁移细胞数和平均侵袭细胞数相比，干扰组胃癌MGC-803和BGC-823细胞视野平均迁移细胞数和平均侵袭细胞数均显著减少，差异有统计学意义（P＜0.001），见表4。

表4 干扰LINC01207表达对MGC-803和BGC-823细胞迁移和侵袭的影响（个，±s）

表4 干扰LINC01207表达对MGC-803和BGC-823细胞迁移和侵袭的影响（个，±s）

组别 MGC-803迁移细胞数无处理组 374.00±28.67对照组 395.80±21.17干扰组 193.20±22.08 F值 105.5 P值 ＜0.001侵袭细胞数304.00±31.81 306.00±17.59 194.00±21.74 36.55＜0.001 BGC-823迁移细胞数 侵袭细胞数353.80±33.00 236.20±24.266 340.20±32.41 252.40±23.59 224.80±21.74 133.60±20.40 28.85 39.87＜0.001 ＜0.001

3 讨论

胃癌患者的总体预后较差，中晚期胃癌患者5年生存率约为25%［9］。LncRNAs在胃癌等许多恶性肿瘤的早期诊断、预后评估及临床治疗上具有重要潜在价值［11］。比如LncRNA19在胃癌中高表达，循环型LncRNA19对胃癌的诊断及预后具有重要的临床价值［12］。最近的研究表明LINC01207在肿瘤发生和恶性进展中起着至关重要的作用。如Wang等［7］报道LINC01207在肺腺癌中的特异性高表达，在体内和体外均能促进肺腺癌细胞的存活，此外，较高的LINC01207表达水平则提示晚期TNM分期和较短的生存期。Zeng等［13］研究显示，LINC01207参与cAMP信号转导和粘蛋白型O-糖能生物合成途径，可作为结肠腺癌诊断和治疗的有效分子靶点。Liu等［8］研究发现LINC01207在胰腺癌中高表达，沉默LINC01207表达能够抑制胰腺癌细胞生长，还能促进细胞凋亡和自噬。然而，Chi等［6］发现LINC01207在恶性胶质瘤细胞和癌组织中均显著低表达，LINC01207的低表达与胶质瘤患者侵袭情况和肿瘤分级有关；此外，LINC01207明显抑制细胞增殖和存活。以上研究证实，LINC01207在多种恶性肿瘤发挥重要的调控作用。本研究发现，与癌旁正常组织相比，胃癌组织中LINC01207的表达水平显著上调，证实LINC01207在胃癌组织中高表达，可能发挥癌基因的作用。这结果与其在肺腺癌中、结肠腺癌和胰腺癌中表达一致，都是高表达，而与其在恶性胶质瘤中表达不一致。LINC01207在不同癌组织中的存在差异表达可能与其在不同肿瘤中发挥不同功能有关。本研究发现胃癌患者组织中LINC01207相对表达水平与肿瘤大小、淋巴转移、TNM分期、CEA水平、CA19-9水平和CA724水平显著相关，提示LINC01207的异常表达与胃癌发展密切相关。LINC01207表达水平诊断胃癌的ROC曲线下面积为0.902，具有较高的灵敏度和特异性。但是由以上文献可知LINC01207在肺腺癌、胰腺癌以及结肠腺癌中也高表达，所以LINC01207对胃癌来说是非特异性的预测标志物，只能作为胃癌诊断的辅助标志物。

大量实验证据支持lncRNA作为竞争性内源性RNA，竞争性吸附miRNA上调靶基因的表达［14］。比如，LINC01207通过竞争性吸附miR-1972，下调其表达从而上调LIM和SH3蛋白1促进前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤形成［18］。本研究发现，胃癌细胞中LINC01207的表达水平均显著高于正常胃黏膜细胞。干扰LINC01207表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭产生显著的抑制效应。这与其在肺腺癌和胰腺癌中的作用相似，表明LINC01207在胃癌细胞中发挥癌基因的功能。关于LINC01207在胃癌中是否也通过竞争性吸附某些特定miRNA调控相应的靶基因来影响胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭的具体机制仍需要进一步研究。

综上所述，LINC01207在胃癌中高表达，干扰LINC01207表达能够抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，LINC01207可能成为胃癌诊断标志物以及干预治疗的新靶点。