外源海藻糖和氯化胆碱对油菜苗期干旱胁迫的缓解效应分析*

牛 远，石沁荣，吴冉迪，李玲芬，刁玉强，曾德峻，苏 航，张国良

(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003)

油菜 (Brassica napusL.)是人类食用植物油的重要来源之一。中国是油菜生产大国，产量约占全球总量的1/3[1]。长江流域是中国油菜主要种植区，然而该区域年降水量分布不均匀，特别是秋旱和春旱频发，已成为限制油菜生产和发展的重要因素之一。秋季干旱时长江流域油菜正值苗期，严重影响油菜的生长发育，最终使油菜减产达32%[2]。因此，对油菜苗期抗旱性机理及缓解机制的研究，具有重要的理论价值和现实意义。

国内外学者做了大量关于油菜苗期的抗旱性研究报道，这些研究选择的指标主要有生长发育指标和生理生化指标[3-5]。洪双等[6]对107 份甘蓝型油菜微核心种质进行的耐旱鉴定中，从叶片萎蔫指数、旱害指数和6 个生物量指数中筛选出地上部鲜质量、总鲜质量和旱害指数进行苗期的耐旱性鉴定。李真等[7]从6 个形态和生物量指标中选择地上部干质量、根干质量和总干质量作为油菜DH 群体苗期抗旱性的主要评价指标。谢小玉等[8]对10 个油菜品种7 个生理指标和叶面积的变化进行研究，认为叶片相对含水量、丙二醛含量和叶面积可作为油菜苗期抗旱性鉴定的首选指标。王道杰等[9]对20 个油菜品种苗期叶片生理生化指标、叶片温度和成活率进行分析，认为抗坏血酸过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性以及可溶性蛋白含量可作为主要的抗旱性评价指标。然而，以上研究主要侧重于对单一类型指标进行研究，缺乏不同类型性状相结合的综合表现，很可能影响苗期耐旱评价结果的准确性。

氯化胆碱和海藻糖是2种常用的植物生长调节剂，在植物抗旱研究中有重要应用。氯化胆碱进入植物体后代谢为甜菜碱和磷脂酰胆碱[10]，在逆境下起到渗透调节和保护细胞膜的作用[11]。海藻糖是一种潜在的渗透保护剂，已被证明能有效稳定脱水酶、蛋白质和类脂膜，并保护生物结构在干燥过程中不受损伤[12]。对水稻[13]、玉米[14]、小麦[15]和地黄[16]等的研究表明：干旱胁迫下，添加外源氯化胆碱或海藻糖能有效缓解植物生物量降低，增强抗氧化酶活性和非酶抗氧化剂含量等维持细胞稳定性、上调光合和水分关系参数。李慧琳等[17]对干旱胁迫下添加氯化胆碱对油菜幼苗生理特性的影响进行研究，得到了比较有效的结论。然而该研究只选用了1～2 个品种，其适用范围和缓解效应仍需进一步研究。

本研究对10 个油菜品种进行苗期干旱胁迫及添加外源氯化胆碱和海藻糖处理，通过测定8 个形态和生物量指标以及7 个生理指标，考察干旱胁迫和干旱下添加外源物对油菜苗期生长发育和生理特性的影响，并进行耐旱性评价和外源物缓解效应研究，以期为耐旱栽培和育种提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种：美国油王999 (选育自美国农业部)、沣油737 (湖南省农科院作物研究所)、秦妍211 (西北农林科技大学农学院)、秦优33 (陕西杂交油菜育种中心)、秦优19 (陕西杂交油菜研究中心)、淮油18 号(江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所)、华湘油11 号 (湖南亚华种业科学研究院)、秦油10 号 (咸阳市农业科学院)、凯育09(合肥齐民生物技术研究所)和南农油3 号(南京农业大学)，均为中国目前较大面积种植的育成品种。

1.2 方法

1.2.1试验设计

试验于2018 年9 月—2019 年1 月在淮阴工学院作物学试验基地进行。选取饱满健康的油菜种子15 粒播种于高20 cm、直径30 cm的盆中。每盆装基质3.5 kg (基质氮磷钾总养分＞2.0%，有机物总量＞28%，并用多菌灵和敌百虫作灭菌和杀虫处理)，置于防雨棚内。待幼苗长至三叶期时定苗，每盆定植长势一致的幼苗5 株。期间进行统一管理。

长至五叶期进行试验处理。试验共设4 组处理，分别为对照处理(CK)、干旱处理(D)、干旱+外源氯化胆碱处理(D+CC)和干旱+外源海藻糖处理(D+T)。以预试验确定外源氯化胆碱质量浓度为400 mg/L，海藻糖浓度为10 mmol/L。每品种每处理10 盆。采用称重法进行水分控制。于每天18：00 进行称量补水，使CK 组基质含水量保持在75%～80%，D、D+CC 和D+T 处理组基质含水量为30%～35%。外源物处理组隔天喷施1 次。需将外源物溶液均匀喷施于油菜叶片上，以叶片将要滴水为宜。处理14 d 后进行各形态和生物量指标(5 次重复)以及生理指标(3 次重复)的测定。

1.2.2测定项目与方法

8 个形态和生物量指标测定。(1)测定所有植株株高和根长。(2)测定生物量：取5 株植株，清洗并吸干水分后，称量总鲜质量，分离根系和地上部，称量根鲜质量和地上部鲜质量；然后置于烘箱中120 ℃杀青15 min，再80 ℃烘干至质量恒定，称量总干质量、根干质量和地上部干质量；生物量的测定重复5 次。

7 个生理指标测定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定釆用NBT 法；过氧化物酶(peroxidase，POD)活性测定采用愈创木酚法；过氧化氢酶(catalase，CAT)活性测定采用紫外吸收法；丙二醛(malondiadehyde，MDA)测定采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法测定；游离脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮法[18]。

1.2.3耐旱胁迫能力评价

采用15 个单项指标考察外源物的缓解效应，然而单个指标的耐旱结果具有相对片面性，仅用单个指标难以准确界定外源物的综合缓解效应。基于此，引入所有指标相对值的主成分分析和隶属函数法对外源物的缓解效应进行综合评价。

采用以下公式计算各单项指标的相对值(RI)。

式中，CKi和Xi分别为对照和各处理下的指标测定值；n为指标个数。

参考罗俊杰等[19]、汪灿等[20]、王倩等[21]和郜欢欢等[22]的方法进行耐旱性综合评价。各干旱处理下，第i个材料第j个综合指标的隶属函数值[μ(xij)]用公式(2)计算。

式中，xij为第i个材料第j个综合指标值；xjmax和xjmin分别为第j个综合指标的最大值和最小值；n为综合指标数。

根据公式(3)计算各综合指标权重系数(ωj)。

式中，Pj为第j个综合指标的贡献率，其值由主成分分析获得。

根据μ(xij)和ωj，按公式(4)计算耐旱性综合评价值(E)。

1.2.4数据分析

利用SPSS 19.0 软件对15 个性状进行双因素方差分析，因素主要考虑处理(4 个)和品种(10个)。用Duncan’s 多重比较法对不同处理间的差异性进行比较分析。由SPSS 19.0 软件完成主成分分析、聚类分析、相关性分析和回归分析。由SPSS19.0 软件完成主成分分析、聚类分析、相关性分析和回归分析。

2 结果与分析

2.1 油菜苗期各指标的两因素方差分析

由表1 可知：处理效应除对CAT 活性影响不显著外，对油菜苗期其他指标均有极显著影响；品种效应对CAT 活性影响显著，对其他指标影响达到极显著水平；处理和品种互作效应除对根长和SOD 活性无显著影响外，对其他指标均产生极显著的影响。

表1 油菜各指标的方差分析Tab.1 The variance analysis of indexes of rapeseed

2.2 不同处理对各指标的影响

2.2.1生物量和形态指标

由图1 可知：各生物量指标在4 个处理间呈现一致的变化趋势。干旱胁迫导致6 个生物量指标较CK 显著下降，下降幅度为32.21%～82.06%。干旱胁迫下添加外源物海藻糖或氯化胆碱，与干旱不施外源物处理相比，各生物量指标均增加，其中3 个干生物量指标增幅为9.97%～44.91%，鲜生物量增量达到102.20%～172.81%，且各指标在海藻糖处理下的指标值均显著大于氯化胆碱处理。形态指标株高和根长呈现一致的变化趋势(图2)。干旱胁迫导致株高和根长较CK 显著下降(42.11%～43.90%)；干旱胁迫下添加外源物，与干旱胁迫相比，株高和根长均显著增加(16.94%～30.96%)，但2种外源物间并无显著差异。

图1 海藻糖和氯化胆碱对干旱胁迫下油菜苗期生物量指标的影响Fig.1 Effects of trehalose and choline chloride on the biomass indicators in rapeseed at seedling stage under drought stress

图2 海藻糖和氯化胆碱对干旱胁迫下油菜苗期形态指标的影响Fig.2 Effects of trehalose and choline chloride on the morphological indicators in rapeseed at seedling stage under drought stress

2.2.2生理指标

由图3 可知：4 个处理下，苗期油菜的CAT活性均无显著差异。干旱胁迫导致可溶性蛋白含量和SOD 活性较CK 显著下降(15.24%～38.75%)，但脯氨酸、可溶性糖和MDA 含量以及POD 活性显著上升(19.84%～786.56%)。干旱添加外源物后，可溶性蛋白含量和SOD 活性相比干旱胁迫显著升高(47.32%～75.75%)，而脯氨酸、可溶性糖和MDA 含量相比干旱胁迫显著降低(24.13%～84.52%)；且除可溶性糖和MDA 含量在2种外源物处理下无显著差异外，海藻糖处理下的其他生理指标值均显著大于氯化胆碱处理。

图3 海藻糖和氯化胆碱对干旱胁迫下油菜苗期生理指标的影响Fig.3 Effects of trehalose and choline chloride on the physiological indicators in rapeseed at seedling stage under drought stress

2.3 外源添加剂的综合缓解效应评价与比较

对供试品种在3种干旱处理下的15 个单项指标相对值进行主成分分析(表2)，提取的前6 个主成分的贡献率分别为41.93%、14.54%、9.93%、8.26%、7.19%和5.39%，其累积贡献率达87.24%，从而将各单项性状指标转换为6 个相互独立的综合指标。主成分载荷矩阵表明：第1 主成分在根鲜质量、总鲜质量、地上部鲜质量、地上部干质量、根干质量、总干质量和株高上有较高荷载量；第2 主成分在可溶性蛋白含量、脯氨酸含量和根长上有较高载荷量；第3 主成分在MDA含量和CAT 活性上有较高载荷量；第4 主成分在POD 活性上有较高载荷量；第5 主成分在可溶性糖含量和株高上有较高载荷量；第6 主成分在SOD 活性和可溶性糖含量上有较高载荷量。

表2 主成分载荷矩阵及方差贡献率Tab.2 Component matrix and variance contribution

由表3 可知：在干旱处理下，供试品种E值变化范围在0.199～0.532，平均值为0.320。根据E值对10 个油菜品种苗期耐旱性进行排序，其中秦油10 号E值最大，表明苗期该品种最耐旱。对E值进行聚类分析，将供试品种划分为3 类。I 类包括秦油10 号和美国油王999 (0.480～0.532)，属于强耐旱型；II 类包括沣油737、秦优33、秦优19、华湘油11 号和凯育09，属于中等耐旱型(0.286～0.371)；III 类包括秦妍211、淮油18 号和南农油3 号，属于不耐旱型(0.199～0.222)。

由表3 还可知：在干旱胁迫下添加氯化胆碱处理，供试品种E值处于0.230～0.579，平均值为0.359；聚类分析也同时将供试品种划分为强耐旱型(0.560～0.579)、中等耐旱型(0.300～0.375)和不耐旱型(0.230～0.240)。与干旱胁迫相比，除南农油3 号由不耐旱型转变为中等耐旱型外，其他品种耐旱类型相对保持不变。添加海藻糖处理时，供试品种E值处于0.141～0.727，平均值为0.421。聚类分析将供试品种划分为强耐旱型(0.549～0.727)、中等耐旱型(0.327～0.404)和不耐旱型(0.141)，同样地，与干旱胁迫相比，南农油3 号和淮油18 号从不耐旱型转变为中等耐旱型，秦优33 从中等耐旱型转变为强耐旱型，其他品种耐旱类型保持不变。

表3 各材料权重、μ(x)值和E 值Tab.3 Value of each variety’s index weight,μ(x) and E-value

综上所述，外源添加剂对干旱胁迫的缓解效果因添加剂和品种的不同而不同。氯化胆碱处理下E值的变化幅度为5.26%～50.57%，海藻糖处理E值的变化幅度为2.61%～102.94%，品种间变异较大。除秦研211 和秦优19 号外，其他8 个品种均以添加海藻糖为优。总体来看，海藻糖对干旱胁迫的缓解效应(平均E值增幅为32.70%)强于氯化胆碱(平均E值增幅为13.57%)。

2.4 耐旱性评价指标的确定和耐旱性预测

对干旱处理下E值与各单项指标相对值相关性分析表明：E值与根干质量(r=0.921)、根鲜质量(r=0.918)、总干质量(r=0.915)、地上部干质量(r=0.911)、总鲜质量(r=0.781)和POD 活性(r=0.844)极显著相关(P＜0.01)，与地上部鲜质量(r=0.754)显著相关(P＜0.05)，因此这些指标能较有效表征油菜品种苗期抗旱特性。

将E值与所有性状单项指标的相对值进行逐步回归分析，得到最优回归方程：E=0.383+0.115x1-0.242x2+0.002x3(x1、x2和x3分别表示根干质量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量的相对值，下同)，方程决定系数R2=0.988，F=170.606(P＜0.001)，方程具有较高拟合性，其中以根干质量为指标的耐旱系数的R2=0.848。该方程可用于油菜苗期耐旱性评价。

同样地，对添加氯化胆碱处理下E值与各单项指标相对值相关分析，E值与根干质量、根鲜质量、总干质量和地上部干质量极显著相关(r=0.891～0.939，P＜0.001)，与总鲜质量、地上部鲜质量和脯氨酸含量显著相关(r=0.683～0.706，P＜0.05)，上述指标能较有效的表征油菜品种干旱胁迫下添加氯化胆碱的耐旱性。回归方程E=0.324+0.120x1-0.057x4(x4表示MDA 含量相对值)，方程决定系数R2=0.942，F=56.378 (P＜0.001)，方程拟合性较好，其中以根干质量为指标的耐旱系数的R2=0.883。该方程可预测油菜干旱胁迫下施加氯化胆碱的耐旱性。

添加海藻糖处理下，E值与根干质量、根鲜质量、总干质量和地上部干质量极显著相关(r=0.907～0.930，P＜0.001)，与总鲜质量、地上部鲜质量和株高显著相关(r=0.633～0.763，P＜0.05)。回归方程E=-0.053+0.213x5+0.102x6+0.054x3(x5和x6分别表示总干质量和POD活性的相对值)，方程决定系数R2=0.993，F=280.314 (P＜0.001)，方程具有较高拟合性，其中以总干质量为指标的耐旱系数的R2=0.848。该方程可用于油菜干旱胁迫下施加海藻糖的耐旱性预测。

3 讨论

干旱是影响油菜生长发育的重要因素。本研究表明：干旱处理对14 个指标产生了显著的影响。通过分析添加外源物海藻糖和氯化胆碱对油菜旱害的缓解效应，结果显示：6 个生物量指标在4 个处理间呈现一致的变化趋势，均按CK、D+T、D+CC 和D的顺序呈现递减趋势。干旱胁迫使生物量显著下降，2种外源物均能不同程度的缓解干旱胁迫下生物量的下降趋势，且海藻糖的缓解效果显著优于氯化胆碱。关于海藻糖的作用机理，ALI 等[14]施用外源海藻糖对干旱胁迫下的玉米进行处理，发现海藻糖通过增加植物光合效率和调节植物水分状况，显著提高干旱下植物的生物量；SUÁREZ 等[23]在菜豆中过表达海藻糖-6-磷酸合酶基因导致海藻糖过量积累，进而上调与碳氮代谢相关的基因和耐逆基因，导致生物量较干旱胁迫极显著增加。就形态指标而言，干旱胁迫下株高和根长显著下降[11]，2种外源物对干旱下株高和根长缓解效果显著，然而其缓解效果无显著差异。

对生理指标研究发现：干旱胁迫下加入外源物后，可溶性蛋白含量和SOD 活性相较干旱下显著上升，表明外源物诱导了二者含量/活性的增加，从而使其发挥重要的抗旱作用，减轻干旱胁迫的伤害，因此MDA 含量显著下降，其他生理指标也发生不同程度的缓解。研究表明：在干旱胁迫下，外源氯化胆碱或海藻糖可增强植物SOD 活性[16-17]，促进可溶性蛋白积累[24]，降低MDA 含量[16-17]，有效缓解干旱胁迫的生理伤害。进一步研究发现：除可溶性糖和MDA 含量在外源物间无显著差异外，其他指标海藻糖提升效果均显著优于氯化胆碱。ALI 等[14]发现：施用外源海藻糖能提高干旱逆境下玉米抗氧化酶POD 和非酶化合物(生育酚、酚)的活性，从而显著提高玉米植株的抗旱性，与本研究较为一致。

综合耐旱性评价表明：添加外源物后，大多数品种在海藻糖作用下E值增幅更大。由于品种与处理存在极显著的互作，各品种E值变化幅度不同。氯化胆碱处理下，耐旱性最弱的品种南农油3 号缓解幅度最大(50.57%)，而耐旱性强的品种秦油10 号缓解幅度最小，仅为5.26%。李慧琳[24]研究认为：氯化胆碱对干旱敏感型品种苏油10 号的缓解效果优于耐旱品种秦优7 号，这与本研究结果一致。海藻糖处理下，不耐旱品种南农油3 号和淮油18 号提升幅度均较大(102.94%和53.16%)，而耐旱强的品种秦油10 号和美国油王999 缓解幅度亦较大(33.39%～36.58%)。总体效果上，海藻糖能起到更好的缓解干旱胁迫伤害的效果(E值平均变化幅度较大)。课题组前期关于蕾薹期的研究表明：蕾薹期添加氯化胆碱能更好地抵御干旱逆境[25]，这与油菜苗期研究相异，表明植物调节剂调控植物抗旱的错综复杂性，其机理亟待深入研究。

抗旱的最优回归方程表明：根干质量、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量共同决定了耐旱值。其中，根干质量在决定耐旱能力上起着最重要的作用(R2=0.848)。通过相关性分析发现：根干质量与总干质量、地上部干质量和根鲜质量的相关系数最大(r=0.983～0.993，P＜0.001)，且总干质量、地上部干质量、根鲜质量与E值的相关系数极显著。干旱胁迫下添加海藻糖或氯化胆碱的相关分析和回归分析表明：上述4 个指标是度量外源物增强抗旱性的首选指标。这与朱宗河等[26]和李真等[7]将干质量和根系生物量作为耐旱评价指标的研究是一致的。

4 结论

干旱胁迫下，油菜苗期形态和生物量指标显著下降，而生理指标脯氨酸、可溶性糖和MDA含量以及POD 活性显著上升，可溶性蛋白含量和SOD 活性显著下降。加入外源海藻糖或氯化胆碱可显著缓解形态和生物量指标的下降，可溶性蛋白含量和SOD 活性相较干旱下显著上升，MDA、脯氨酸和可溶性糖含量则显著下降；且除株高、根长、CAT 活性、可溶性糖含量和MDA含量外，其余指标均表现为海藻糖处理显著优于氯化胆碱处理。耐旱性综合评价表明：海藻糖缓解干旱胁迫伤害的效果强于氯化胆碱，且在品种间变异较大。外源物(尤其是海藻糖)可用于油菜的耐旱性生产实践，对油菜苗期耐旱性栽培具有一定的指导意义。