EGCG对急性热应激肉鸡抗氧化能力的影响

张 成 赵 菲 李 煬 张 勇 王 驰 耿照玉

(安徽农业大学 动物科技学院，合肥 230036)

环境温度骤然升高而引发的热应激现象引起了家禽生产者的普遍关注。家禽受到急性热应激时会使器官受损，进而导致生理机能紊乱，最终影响家禽正常生长发育和健康，造成较大的经济损失[1-2]。研究表明，热应激状态下，家禽抗氧化系统失衡，导致机体内活性氧自由基(ROS)增高，诱发机体发生氧化应激损伤[3]。因此，研究如何减少热应激对肉鸡的氧化损伤显得尤为重要。研究显示，饲粮中添加具有抗氧化活性的植物源活性物质是缓解热应激肉鸡氧化应激损伤的有效途径[4]，其中多酚类物质表现效果很佳[5-8]。茶多酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌以及清除自由基等多种生物学功能，其主要成分为儿茶素，而表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)占儿茶素80%[9]。研究表明，EGCG可降低细胞内ROS及脂质过氧化水平，提高细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性，表明EGCG有显著的抗氧化效果[10]。Wada等[11]研究表明，EGCG可以提高小鼠胰岛细胞的活力和抗氧化功能，可能与其提高核因子E2相关因子2(Nrf2)和亚铁血红素加氧酶1(HO-1)mRNA的表达量并减少ROS的生成有关。韩国清等[12]在仔猪日粮中添加EGCG显著提高了仔猪的采食量和血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低血清丙二醛(MDA)含量，表明EGCG能缓解仔猪断奶后的氧化应激，提高生产性能。热应激的时长、温度高低及模式(持续和循环)对家禽抗氧化系统的影响存在差异[3]。研究表明，慢性热应激条件下，饲粮中添加EGCG通过提高肉鸡血清和肝脏GSH-Px、SOD和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性，降低MDA水平来改善肉鸡生长性能并减轻应激损伤，同时提高肝脏中Nrf2蛋白的表达水平[13-14]，提示EGCG提高慢性热应激肉鸡抗氧化能力可能介导了Nrf2信号通路，但其具体机制仍需进一步探究。然而关于EGCG对急性热应激肉鸡抗氧化能力的影响还未有相关研究，如何改善急性热应激肉鸡的抗氧化能力，其具体机制是否与Nrf2信号通路介导相关，值得进一步研究。因此，本研究以淮南麻黄肉鸡为研究对象，旨在考察饲粮中添加EGCG对急性热应激肉鸡抗氧化能力的影响并初步探究其机理，以期为其作为绿色、安全的饲料添加剂应用于家禽生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

选取10日龄体重(170±2) g的淮南麻黄公鸡144羽，随机分为3组：对照组(Ⅰ组)、急性热应激组(Ⅱ组)、急性热应激+EGCG组(Ⅲ组)，每组6个重复，每个重复8羽。Ⅰ组和Ⅱ组饲喂基础饲粮，Ⅲ组饲喂在基础饲粮中添加400 mg/kg EGCG的试验饲粮。10～21日龄，环境温度由30 ℃降温至(22±1) ℃，随后保持该温度至93日龄。94日龄时，Ⅰ组环境温度维持为(22±1) ℃，Ⅱ组和Ⅲ组环境温度升高到(33±1) ℃，维持该温度12 h并禁食，热应激处理后屠宰取样。鸡舍用排风扇进行纵向通风，用加湿器控制湿度(相对湿度65%左右)，用加热器控制温度。

1.2 饲养管理

试验在安徽农业大学试验基地开展，试验鸡自由采食和饮水，常规管理。基础饲粮参照《鸡饲养标准》(NY/T 33-2004)配制，基础饲粮组成及营养成分见表1。EGCG纯度为98%，购自杭州怡倍嘉茶叶科技有限公司。

表1 饲粮组成与营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets (air-dry basis)

1.3 样品采集

在每个重复中随机选取体重相近的2羽肉鸡，翅静脉采血5 mL，3 000 r/min离心15 min，分离血清，置于-20 ℃保存待测。采血后，颈静脉放血处死后，迅速打开腹腔，采取肝脏、脾脏、空肠样品，装于无菌的冻存管并液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存待测。

1.4 检测指标

1.4.1器官指数的测定

取肝脏、肌胃、脾脏、十二指肠、空肠、回肠称重，计算器官指数。

肝脏指数=肝脏质量/体重
肌胃指数=肌胃质量/体重
脾脏指数=脾脏质量/体重
十二指肠指数=十二指肠质量/体重
空肠指数=空肠质量/体重
回肠指数=回肠质量/体重

1.4.2血清和组织器官中抗氧化指标测定

血清和组织器官中CAT、GSH-Px、总SOD(T-SOD)活力以及蛋白羰基(PC)和MDA含量采用南京建成生物工程研究所的试剂盒按照说明书进行测定。组织样品制备过程如下：称取空肠、肝脏和脾脏样品(0.5～1.0 g)，按质量(g)∶体积(mL)=1∶9 的比例加入预冷的生理盐水，在冰浴条件下用匀浆机匀浆，然后于4 ℃冷冻离心机中3 500 r/min离心10 min，取上清液进行测定。采用的仪器为SUNRISE酶标仪和TU-1900紫外可见光分光光度计。

1.4.3肝脏中Nrf2通路相关基因表达测定

采用上海Yeasen生物技术公司的Trizol试剂提取肝脏总RNA，用Nano-drop 2000分光光度计在260和280 nm处测定吸光度值，进行RNA纯度检测。检测合格后反转录成cDNA。利用NCBI搜索目标基因序列，运用Primer 5进行引物设计，引物由安徽通用生物科技有限公司合成。基因表达水平用ABI 7500实时定量PCR仪进行测定。qRT-PCR 反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O 6 μL。选择β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，使用2-ΔΔCt方法计算目的基因的表达量。引物序列及参数见表2。

表2 Nrf2信号通路相关基因的引物序列Table 2 Primers sequences for Nrf2 signaling pathway-related genes

1.5 数据处理与统计分析

试验数据以平均值±标准误表示，使用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著作为判断标准。

2 结果与分析

2.1 EGCG对急性热应激肉鸡器官指数的影响

由表3可见，急性热应激和EGCG对肝脏指数、肌胃指数、十二指肠指数、空肠指数和回肠指数均无显著影响(P>0.05)。然而，与Ⅰ组相比，Ⅱ组肉鸡脾脏指数显著下降(P<0.05)，提示急性热应激损害了肉鸡的器官免疫功能。

表3 EGCG对急性热应激肉鸡器官指数的影响Table 3 Effects of EGCG on organ index of acute heat-stressed broilers g/kg

2.2 EGCG对急性热应激肉鸡血清抗氧化功能的影响

由表4可见，尽管急性热应激和EGCG对血清中MDA、PC含量和GSH-Px活力均无显著影响(P>0.05)，但与Ⅰ组相比，Ⅱ组肉鸡血清中MDA和PC含量分别提高了77.19%和25.14%(P<0.10)；与Ⅱ组相比，Ш组肉鸡血清中MDA和PC含量分别降低了42.57%和21.19%。另外，与Ⅰ组相比，Ⅱ组肉鸡血清中T-SOD和CAT活力显著降低(P<0.05)；与Ⅱ组相比，Ш组肉鸡血清中CAT和GSH-Px活力分别提高了48.87%和20.13%(P<0.10)。上述结果提示，EGCG可提高急性热应激肉鸡机体的抗氧化功能。

表4 EGCG对急性热应激肉鸡血清抗氧化功能的影响Table 4 Effects of EGCG on antioxidant function in serum of acute heat-stressed broilers

2.3 EGCG对急性热应激肉鸡脾脏抗氧化功能的影响

由表5可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组肉鸡脾脏中T-SOD 和CAT活力显著降低(P<0.05)；与Ⅱ组相比，饲粮中添加EGCG可显著提高急性热应激肉鸡脾脏中CAT活力(P<0.05)，提示EGCG对急性热应激肉鸡脾脏抗氧化活力有显著的提高效果。

表5 EGCG对急性热应激肉鸡脾脏抗氧化功能的影响Table 5 Effects of EGCG on antioxidant function in spleen of acute heat-stressed broilers

2.4 EGCG对急性热应激肉鸡空肠抗氧化功能的影响

由表6可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组肉鸡空肠中MDA含量显著上升(P<0.05)；与Ⅱ组相比，饲粮中添加EGCG可显著降低急性热应激肉鸡空肠中MDA含量(P<0.05)，表明EGCG能降低急性热应激肉鸡空肠的氧化损伤。

表6 EGCG对急性热应激肉鸡空肠抗氧化功能的影响Table 6 Effects of EGCG on antioxidant function in jejunum of acute heat-stressed broilers

2.5 EGCG对急性热应激肉鸡肝脏抗氧化功能的影响

由表7可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组肉鸡肝脏中T-SOD和GSH-Px活力显著降低(P<0.05)，MDA和PC含量极显著上升(P<0.01)；与Ⅱ组相比，饲粮中添加EGCG可显著提高急性热应激肉鸡肝脏中GSH-Px活力(P<0.05)，同时极显著降低MDA含量(P<0.01)。上述结果提示，EGCG对急性热应激肉鸡肝脏的抗氧化能力有显著的提高效果。

表7 EGCG对急性热应激肉鸡肝脏抗氧化功能的影响Table 7 Effects of EGCG on antioxidant function in liver of acute heat-stressed broilers

2.6 EGCG对急性热应激肉鸡肝脏Nrf2信号通路中关键基因表达的影响

由表8可知，与Ⅰ组相比，Ⅱ组肉鸡肝脏中Nrf2、CAT和NQO1mRNA表达量显著降低(P<0.05)，GSH-PxmRNA表达水平极显著降低(P<0.01)，而Keap1mRNA表达量显著升高(P<0.05)；与Ⅱ组相比，Ⅲ组肉鸡肝脏中CATmRNA表达量显著升高(P<0.05)。上述结果提示EGCG提高急性热应激肉鸡肝脏抗氧化能力可能介导了Nrf2信号通路。

表8 EGCG对急性热应激肉鸡肝脏Nrf2信号通路相关基因表达的影响Table 8 Effects of EGCG on the expression of Nrf2 signaling pathway-related genes in liver of acute heat-stressed broiler

3 讨 论

3.1 EGCG对急性热应激肉鸡器官指数的影响

器官指数是衡量动物机体系统发育状况和功能的重要指标。对于家禽而言，脾脏是最为重要的免疫器官，其生长发育是家禽免疫系统功能的基础[15]。大量研究表明，热应激会使机体器官发育受阻，免疫器官指数显著降低，脾脏表现尤甚[16]，这主要是由于热应激一方面导致了脾脏炎症的发生，另一方面导致了抗氧化系统受损，最终导致脾脏细胞的凋亡。与此一致，本研究表明，急性热应激显著降低了肉鸡脾脏指数。Zhang等[6]研究表明，白藜芦醇(多酚类物质)可显著降低慢性热应激对肉鸡脾脏等器官指数的负面影响。然而，Aydogan等[17]研究表明，同为多酚类物质的EGCG对正常饲养条件下肉鸡肝脏、心脏、脾脏、胰腺和法氏囊指数均无显著影响。此外，本研究发现，EGCG对急性热应激肉鸡器官指数无显著影响，但其如何影响慢性热应激条件下肉鸡的器官指数尚需深入研究。

3.2 EGCG对急性热应激肉鸡血清和组织器官抗氧化能力的影响

肉鸡对高温有一定的耐受性，但该能力是有限的，随着温度的升高和时间的延长，机体内的氧化还原平衡被破坏，ROS大量聚集并诱导氧化应激，导致细胞脂质、蛋白质和DNA过氧化[18]。血清抗氧化酶的变化反映了动物机体抗氧化能力的改变，而MDA和PC含量反映了机体氧化损伤的程度[19]。前期研究发现，37 ℃的高温可导致雪峰乌骨鸡血清中GSH-Px、CAT等抗氧化酶活性显著降低，抗氧化能力减弱，脂质发生过氧化反应[5]，而营养调控可有效提高抗氧化酶活性[20]。EGCG的B环上含有活跃的羟基氢，可用于清除自由基，是纯天然的高效抗氧化剂。研究表明，EGCG能显著降低慢性热应激肉鸡血清中MDA含量，显著升高抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px活性，表明EGCG可通过提高抗氧化酶活性，进而缓解热应激导致的氧化损伤[13,19]。本研究表明，饲粮中添加EGCG可分别提高急性热应激肉鸡血清中GSH-Px和CAT活力达20.13%和48.87%，同时降低血清中MDA和PC含量达42.57%和21.99%，说明EGCG在一定程度上改善了肉鸡机体的抗氧化能力，缓解了急性热应激引起的氧化应激，但其作用机理需要进一步探究。

热应激是影响肠道形态和功能的主要因素之一，小肠作为家禽消化吸收营养物质的主要场所，对家禽的生长发育起着至关重要的作用[21]。当家禽处于热应激状态下，一方面高温引起的氧化应激破坏了抗氧化系统[22]，另一方面机体为了加快散热，会加速血液流向体表，使得流向肠道的血液大大减少，导致肠道供血不足，从而造成肠道细胞的凋亡，坏死甚至脱落等现象，是肠道病变和黏膜损伤的重要原因[23]。雷昕[9]研究发现，饲粮添加EGCG可显著提高慢性热应激肉鸡空肠中GSH-Px、SOD和CAT活性，同时降低MDA含量，提示其显著提高了慢性热应激肉鸡空肠抗氧化性能，并降低氧化损伤。本研究表明，急性热应激和EGCG对肉鸡空肠抗氧化酶无显著影响，但急性热应激显著提高了肉鸡空肠中MDA含量，而饲粮中添加EGCG可显著将其降低，说明EGCG可有效降低急性热应激对肉鸡肠道的氧化损伤。

脾脏作为最重要的外周免疫器官，参与细胞和体液免疫过程。Zhang等[6]研究证明，慢性热应激显著降低肉鸡脾脏中CAT、T-AOC和T-SOD活力，同时显著提高MDA含量，表明热应激对肉鸡脾脏抗氧化能力有抑制作用，而饲粮添加白藜芦醇具有显著的缓解作用。尽管EGCG具有抗氧化作用，但其对热应激肉鸡脾脏抗氧功能的调控作用还未见报道。本研究发现，急性热应激显著降低了脾脏中T-SOD和CAT活力，而饲粮中添加EGCG可显著提高急性热应激肉鸡脾脏中CAT活力，提示其可有效缓解急性热应激对肉鸡脾脏抗氧化功能的负面作用。

肝脏作为动物体内最重要的器官之一，具有代谢和解毒的作用。肉鸡分别在35和38 ℃的环境中暴露3 h后，肝脏中MDA和PC的含量显著升高，表明肉鸡暴露于高温下会导致肝脏脂质和蛋白质的氧化损伤[24]。体外试验表明，EGCG可提高人体肝细胞SOD活性，同时降低MDA含量，提示其可提高肝细胞抗氧化能力，同时降低氧化损伤[25]。薛菠[14]研究发现，饲粮中添加EGCG可显著提高慢性热应激肉鸡肝脏中SOD、GSH-Px和CAT的活性，同时显著降低MDA含量。本研究表明，急性热应激肉鸡肝脏中MDA和PC含量极显著升高，T-SOD 和GSH-Px活力显著降低，而饲粮中添加EGCG可极显著降低急性热应激肉鸡肝脏中MDA含量，同时显著提高GSH-Px活力，表明EGCG能有效提高急性热应激肉鸡肝脏抗氧化能力，从而缓解急性热应激对肝脏造成的损伤。可见，EGCG具有良好的护肝作用，能有效缓解急性和慢性热应激对肉鸡肝脏抗氧化功能的损害，缓解肝脏氧化损伤。

3.3 EGCG对急性热应激肉鸡肝脏Nrf2信号通路抗氧化基因表达的影响

大量研究表明，Nrf2作为抗氧化系统中重要的转录因子[26-27]，对于维持机体氧化平衡以及调控下游CAT和NQO1等抗氧化酶基因的表达具有至关重要的作用[28-30]。敲除Nrf2基因的小鼠对氧化应激的敏感性增加，而使用激活剂增强Nrf2的表达可在一定程度上保护动物免受氧化损伤。EGCG是绿茶多酚中含有的Nrf2活化剂，Wang等[31]研究表明饲粮中添加EGCG可上调蛋鸡子宫Nrf2和HO-1mRNA表达量，从而提高蛋鸡的抗氧化能力，缓解钒诱导的氧化应激。薛波[14]研究表明，EGCG可显著提高慢性热应激肉鸡肝脏中Nrf2蛋白的表达水平。本研究显示，急性热应激显著降低肉鸡肝脏中Nrf2、GSH-Px、CAT和NQO1的mRNA表达量，并显著提高Keap1的mRNA表达量，这可能是急性热应激导致肉鸡发生氧化应激损伤的主要原因，而饲粮中添加EGCG可显著提高急性热应激肉鸡肝脏中CATmRNA表达量，说明EGCG可能介导激活Nrf2信号通路提高机体抗氧化能力，进而有效缓解急性热应激导致的氧化损伤。但具体机制尚需进一步研究，后续研究可进一步检测Nrf2信号通路关键蛋白的表达水平，如结果与mRNA水平的结果一致，则可进一步在细胞水平开展研究，基于Nrf2信号通路揭示EGCG缓解肉鸡急性热应激的机制。

4 结 论

饲粮添加EGCG可提高急性热应激肉鸡抗氧化能力，进而缓解急性热应激造成的氧化损伤，其机制可能与EGCG激活Nrf2信号通路关键抗氧化基因表达有关。