党参-茯苓-甘草水提物通过激活胆碱能信号通路改善痴呆小鼠的学习记忆功能

徐飞飞，管雅琪，崔恺，王立有，李欣娱，李钦青，田雅娟，楚世峰，贺文彬*

（1.山西中医药大学中药与食品工程学院，中医脑病学山西省重点实验室，山西太原 030624）（2.中国医学科学院药物研究所，北京 100050）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以学习记忆障碍为主要临床症状的进行性神经变性疾病[1]。据世界卫生组织（WHO）统计，全球约有5000万人患有痴呆症，而AD患者占到60%～70%[2]。AD的病理改变主要为多种异常蛋白的累积，如β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）沉积、tau蛋白过度磷酸化，由它们引起的的老年斑（SP）及神经原纤维缠结（NFTs）最终均会诱导胆碱能神经元大量丢失，所以研究胆碱能系统对学习记忆障碍的治疗具有重要的指导意义[3,4]。现今国内外临床批准广泛使用的药物，如多奈哌齐、利斯地明等，也均基于“胆碱能学说”作为胆碱酯酶抑制剂对AD起到有效的改善作用[5]。由于AD是逐步发病，目前并没有治愈AD或改变AD病程发展的有效方法。近年来研究表明，发现及治疗疾病的时间晚，并且临床试验药物作用靶点过于单一，可能是造成抗阿尔茨海默病（AD）新药临床试验的失败的主要原因；并且其病理早期（即学习记忆障碍阶段）常被忽视，在此阶段适当干预可减缓病程发展，所以说对于AD的预防大于治疗[6,7]。

学习记忆障碍阶段症状主要表现短期记忆力的下降，这与中医的“呆病”、“健忘”等病证相似[8]。《素问·宣明五气篇》记载“脾藏意与智”，脑为髓之海，由脏腑之精气汇聚而成。中医认为“后天之本在脾”，脾主运化，为气血生化之源，可将水谷精微运化至脑，以养脑髓；若后天失养，气血津液运化无力，不能充养脑髓，神机失用[9-11]。传统中医理论指导下，中草药，尤其是“药食同源”类中药，对疾病的预防具有显著效果[12,13]。党参（Radix codonopsis）性味甘平，可补中益气，健脾养血。茯苓（Poria cocos）甘淡平，益脾和胃，宁心安神。甘草（Glycyrrhizaeradix）甘平，补脾益气，调和诸药。蜜炙甘草药性温和，补脾和胃。党参茯苓相配，可补脾胃之气而无碍胃之弊，茯苓性淡，可渗湿，顺应脾胃气化。甘草味甘，斡旋中焦，平补气血，全方补而不滞，滋而不腻，着眼于中焦，尤重于脾。脾胃得养则气血生化有源，气血足则能上充于脑，脑髓充足则耳目聪明。

党参作为一种补益药被广泛熟知，是桔梗科草本植物党参[Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.]和素花党参（Codonopsis pilosulaNannf. var. modesta Nannf. L.T. Shen）的干燥根，其主要活性成分为党参皂苷及党参多糖[14]。经数据挖掘研究发现，中药治疗AD的临床及动物实验研究药物中，补虚药是核心药物的主要类别[15]。党参作为补气药，具有健脾益肺，养血生津的功效，近年来研究认为党参除了在血液循环系统及免疫系统中的重要作用外，其活性成分党参多糖能够增加大脑乙酰胆碱能受体表达、清除自由基，起到改善记忆的作用[16]。在中药治疗AD的临床研究中，茯苓及甘草使用频率分别为3.58%和3.42%；动物实验研究中，使用频率分别为4.65%和2.60%，二者在33味常用于治疗AD中药中分别排名第五、六位[15]。研究提示，茯苓多糖及甘草酸类成分为两味中药改善学习记忆的主要活性成分[17,18]。

本课题组经前期研究，以“药食同源”中药潞党参、茯苓、甘草配伍，发现其水提物能够通过抗氧化及增强免疫功能起到改善学习记忆障碍的作用[19]。中药中含有多种活性成分，能够通过多靶点、多途径，在改善病因不清、发病机制复杂的疾病中发挥优势[8]。为深入探究水提物对学习记忆障碍的其他改善途径，现采用腹腔注射氢溴酸东莨菪碱制备小鼠学习记忆障碍模型，验证水提物能否影响经典学说“胆碱能学说”相关靶点。通过Morris水迷宫实验观察党参-茯苓-甘草水提物的记忆障碍改善作用，检测海马内乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）水平和乙酰胆碱脂酶（acetylcholinesterase，AchE）活力，测定乙酰胆碱相关蛋白表达量，从胆碱能信号通路探讨党参-茯苓-甘草水提物对小鼠学习记忆障碍的改善作用及机制。本研究补充了潞党参、茯苓、甘草三味中药改善学习记忆障碍的作用靶点及作用途径，为今后“药食两用”中药多靶点预防疾病提供了实验基础，更为中药资源保健功能的开发提供研究方向。

1 材料与方法

1.1 受试动物

SPF级雄性健康昆明（KM）小鼠，八周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。小鼠于实验前7 d置于清洁级实验室适应环境，自由饮食、摄水。本文所做实验均获得伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

潞党参、茯苓、甘草，药材采购厂家及批号同文献[19]；盐酸多奈哌齐，购自卫材（中国）药业有限公司；氢溴酸东莨菪碱，购自湖北佳诺信生物化工有限公司；Ach、AchE试剂盒（货号：RA20055、MU30372），购自武汉贝茵莱生物科技有限公司；α7-nAChR抗体（货号：GTX64511），购自Gene Tex公司；CaMKII、ERK1/2、p-ERK1/2、p-CREB、β-actin抗体（货号为：ab52476、ab17942、ab201015、ab32096、ab8227），均购自Abcam公司。

Heraeus Multifuge X1R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技公司；Waters e2695高效液相色谱仪、Waters Symmetry C18液相色谱柱，沃特世科技有限公司；JY92-IIN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；VERSA max酶标仪（BNRO5709），上海美谷分子仪器有限公司；R540增强型动物麻醉机、ThermoStar 69020小鼠体温维持仪，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；JLBehv-MWMM大小鼠通用Morris水迷宫，上海吉量软件科技有限公司；Champ Chemi Professional全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统，北京赛智创业科技有限公司；DYY-6D电泳仪，北京六一生物科技有限公司；TE77XP电转仪，豪沃生物科技（上海）有限公司；THZ-92B气浴恒温箱，上海博讯实业有限公司；CP224C分析天平，奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 药液制备

取潞党参粗粉、茯苓粗粉各100 g，甘草20 g，按照《中国药典》2015年版蜜炙法通则0213方法对甘草进行炮制。上述药材加10倍量的水浸泡1 h，煎煮1.5 h。过滤，药渣加8倍量水煎煮1 h。过滤，合并两次滤液，常压浓缩至1 mL药液相当于原药材1 g。依据“人与动物间的等效剂量换算”及课题组前期研究有效剂量，将浓缩液加纯净水稀释至浓度为10、20、40 g/kg（灌胃剂量为10 mL/kg），4 ℃冰箱贮存备用。复方党参煎液于10000 r/min，离心15 min，得上清液，于低温冷冻干燥机干燥。取干燥品10 g，用甲醇定容至20 mL，摇匀，超提取声1 h，抽滤得续滤液，过0.22 μmol/L有机微孔滤膜，得供试品溶液，经高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析得出中药水提液中成分。

1.3.2 实验动物分组

60只KM小鼠，随机分为6组，分别为正常组，模型组，党参-茯苓-甘草低、中、高剂量组（10、20、40 g/kg），阳性药组，每组10只。正常组、模型组小鼠每日灌胃生理盐水，党参-茯苓-甘草组分别灌胃10、20、40 g/kg的药液稀释液，阳性药组灌胃1.5 mg/kg盐酸多奈哌齐，不间断给药30 d（10 mL/(kg·d)）。

1.3.3 Morris水迷宫行为学测试

参照文献方法[12]进行定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验自给药第25 d至第29 d共5 d，灌胃给药结束后，除空白组腹腔注射生理盐水外，其余各组腹腔注射氢溴酸东莨菪碱（2 mg/kg），30 min后将各组小鼠从4个不同象限的入水点面向池壁放入水中，时间为120 s。若小鼠在120 s内未找到平台，将其引至平台，让动物在平台停留30 s后，擦干水分，再放回笼中，每天记录小鼠找到平台的潜伏时间。给药第30 d将平台撤除，按照定位航行试验的方法进行空间探索实验，记录120 s内小鼠在水池4个象限中的游泳路径、时间，计算平台所在象限（第Ⅲ象限）数据占总距离、总时间的百分比及穿越平台的次数，用来反映小鼠对平台所在位置的空间记忆能力，以判断小鼠记忆储存及提取再现能力。

1.3.4 酶联免疫实验

空间探索实验结束后，异氟烷麻醉小鼠。脱颈处死，迅速于冰上断头取脑，用生理盐水冲掉血液，取海马组织，滤纸擦干后称重，两侧海马分装备用。一侧海马组织用超声波细胞粉碎机于冰上制成10%的组织匀浆，低温高速离心机离心（3500 r/min，10 min，4 ℃），取上清液储存于-20 ℃备用。按照ELISA试剂盒操作步骤测定小鼠海马样品中ACh、AChE的水平。

1.3.5 免疫蛋白印迹（Western Blot）实验

将另一侧海马组织按每20 mg组织加入180 μL裂解液的比例加入裂解液，用超声波细胞粉碎机匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4 ℃，12000 r/min，离心15 min，取上清，用BCA试剂盒进行蛋白质定量。将提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，再进行电转使其转移至杂交膜上，本实验选用PVDF膜。再用5%脱脂奶粉（检测磷酸化蛋白用BSA）环境下封闭2 h。根据说明书稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，4 ℃孵育过夜，孵育一抗的膜用TBST洗涤3次，每次10 min。随后根据用量，按照1:2000稀释HRP标记的二抗，与膜室温孵育2 h。用TBST洗涤3次，每次10 min。洗膜后，将ECL化学发光发光液，加在膜的正面于凝胶成像系统暗室中进行扫描，对α7-nAChR、CaMK II、ERK1/2、p-ERK1/2、p-CREB以及β-actin蛋白表达量进行可视化。采用Image J 1.50e图像处理软件通过灰度值分析蛋白表达量，每个蛋白进行三次重复实验（n=3）。

1.4 统计学方法

实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 6.02统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。p<0.05为有显著差异，p<0.01为有极显著差异。

2 结果与讨论

2.1 党参-茯苓-甘草水提物成分高效液相色谱鉴定

经HPLC分析得出参苓草复方水提液中含有少量党参炔苷、猪苓酸C、去氢土莫酸、甘草苷、甘草素、甘草酸铵成分。党参成分党参炔苷色谱图见图1a、b。精密称取干燥至恒重的党参炔苷对照品适量，加甲醇定容，制成含党参炔苷0.0377 mg/mL的对照品溶液。色谱柱为Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸（B），等度洗脱（0～30 min，22% A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长：267 nm。

茯苓成分猪苓酸C、去氢土莫酸色谱图见图1c、d。精密称取干燥至恒重的猪苓酸C、去氢土莫酸对照品适量，加甲醇定容，制成含猪苓酸C0.0707 mg/mL、去氢土莫酸0.0328 mg/mL的对照品溶液。流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸（B），等度洗脱（0～30 min，70% A），检测波长：246 nm。

图1 党参-茯苓-甘草水提物HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of water extract

甘草成分甘草苷、甘草素、甘草酸铵色谱图见图1e、f。精密称取干燥至恒重的甘草苷、甘草素、甘草酸铵对照品适量，加甲醇定容，制成含甘草苷0.2988 mg/mL、甘草素0.0084 mg/mL、甘草酸铵0.6043 mg/mL的对照品溶液。流动相为乙腈（A）-0.85%磷酸（B），梯度洗脱（0～11 min，18% A；11～13 min，18%→22% A；13～21 min，22%→28% A；21～31 min，28% A；31～40 min，28%→42% A；40～60 min，42% A），检测波长：237 nm。

2.2 水提物对学习记忆障碍小鼠行为学影响

长期以来，海马在学习和记忆中起着关键作用，广泛的行为学研究已证实了海马在储存和恢复记忆以及空间导航方面的重要性[20-22]。东莨菪碱作为乙酰胆碱拮抗剂，以胆碱能学说为基础，模拟乙酰胆碱分泌不足造成的学习记忆障碍动物模型[23]。盐酸多奈哌齐通过抑制胆碱酯酶活性，是临床普遍用于治疗轻度、中度老年痴呆的药物，本实验将其作为阳性对照药物。

Morris水迷宫能够评价动物空间学习记忆能力，是一种被应用于痴呆研究的行为学评价指标[24]。本研究经过5 d对小鼠的训练，选取最后一天的测试结果，即穿过平台次数、第Ⅲ象限时间及路程百分比作为评价指标，见表1。与正常组比较，模型组小鼠穿过平台次数、在第Ⅲ象限的时间及路程百分比均显著降低（p<0.05），学习记忆能力明显下降。与模型组比较，高剂量党参-茯苓-甘草组（40 g/kg）小鼠穿越原平台的次数明显增加（p<0.05）；低、中、高剂量党参-茯苓-甘草组（10、20、40 g/kg）小鼠在原平台所在第Ⅲ象限停留时间百分比均明显提高（p<0.05），在剂量范围内呈量效关系；中剂量和高剂量党参-茯苓-甘草组（20、40 g/kg）小鼠在第Ⅲ象限运动路程百分比明显提高（p<0.05）。结果表明，腹腔注射氢溴酸东莨菪碱能够造成小鼠学习记忆损伤，表明学习记忆障碍模型建立成功；党参-茯苓-甘草水提物能够改善学习记忆障碍小鼠的学习记忆障碍行为学表现，其中40 g/kg剂量最佳。

表1 党参-茯苓-甘草对学习记忆障碍小鼠记忆能力的影响Table 1 Effect of water extract on memory ability of learning and memory impairment mice (mean±SD, n=10)

2.3 水提物对胆碱能神经递质ACh及酶AChE的影响

2.3.1 ACh与AChE标准曲线建立

将浓度分别为0、50、100、200、400、800、1600 pmol/L的小鼠ACh标准品设为横坐标，酶标仪检测的OD值为纵坐标，绘得标准曲线的直线方程式：y=1125.4x+62.541（R2=0.9912）；将浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、25、50 U/mg的小鼠AChE标准品设为横坐标，酶标仪检测的OD值为纵坐标，绘得标准曲线的直线回归方程式：y=39.544x-2.9032（R2=0.9943）。将样本OD值带分别入以上标准直线方程式中，计算样品浓度。

2.3.2 胆碱能神经递质ACh浓度及AChE酶活力

乙酰胆碱是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一，与学习、记忆密切相关，海马中ACh水平的降低能够引起学习记忆障碍[12,25]。乙酰胆碱酯酶（AChE），可使ACh水解为胆碱和乙酸，是胆碱能突触通路中神经信号传导的关键酶。正常生理状态下，AChE能够维持Ach含量的稳定，避免其对于突触后膜受体的过度刺激；病理条件下，AChE活性的异常升高，使ACh降解速度加快，从而造成含量显著降低，生物信号不能得到正常传导[26]。

胆碱能神经递质ACh及酶AChE检测结果见表2。与正常组相比，模型组小鼠海马中胆碱能神经递质Ach水平显著下降（p<0.05）；与模型组相比，中剂量和高剂量党参-茯苓-甘草组（20、40 g/kg）小鼠海马中ACh水平显著升高，且20 g/kg剂量作用效果好于40 g/kg。与正常组相比，模型组小鼠海马中乙酰胆碱降解酶AChE活性显著降低（p<0.05）；与模型组相比，中剂量党参-茯苓-甘草组（20 g/kg）小鼠海马中AChE活性显著升高（p<0.05）。研究发现，党参多糖能够改善东莨菪碱、亚硝酸钠、乙醇等诱导的学习记忆障碍模型小鼠学习记忆能力[27-29]。张立等[30]通过党参多糖对铅中毒诱导的小鼠记忆障碍的评价中，发现党参多糖处理的小鼠在Morris水迷宫及跳台实验中表现良好，但AChE作为检测指标，发现党参多糖组与模型组在该指标上并无显著差异，党参多糖是否能够对胆碱能系统产生影响仍与进一步研究。徐煜彬等[31]、高冰冰等[32]均认为茯苓改善东莨菪碱所致学习记忆障碍与降低AChE活性有关。药理研究分析发现，茯苓酸类与茯苓多糖是茯苓发挥改善学习记忆障碍药理活性的主要物质，去氢茯苓酸能够降低Aβ沉积造成的神经细胞毒性，茯苓多糖能够提高抗氧化能力起到抗衰老作用[33-36]。蜜炙甘草药性温和，补脾和胃。张耀峰等[37]发现甘草水提物能够有效缓解阿尔茨海默病发病进程，认为其可能机制与降低AChE活性与氧化应激有关。甘草活性成分甘草酸可通过抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、抗胆碱酯酶等药理作用起到脑保护效果[38]。在体内外实验中发现甘草素能够减轻AD模型细胞及小鼠炎症和凋亡的产生，此外还能够通过抑制Aβ和老年斑的生成，改善AD小鼠学习记忆能力[39]。本研究结果显示，腹腔注射氢溴酸东莨菪碱能够降低小鼠海马中ACh水平造成记忆障碍；ACh水平的降低可能是由于AChE活力升高造成AChE降解速度加快而引起的。所以党参-茯苓-甘草水提物能够通过降低AChE活力，使学习记忆障碍小鼠海马中ACh含量恢复正常水平。

表2 党参-茯苓-甘草水提物对学习记忆障碍小鼠海马ACh水平及AChE活性的影响Table 2 Effect of water extract on Ach content and AchE activity of hippocampus in learning and memory impairment mice (mean±SD, n=10)

2.4 水提物对胆碱能突触信号通路相关蛋白的影响

2.4.1 乙酰胆碱受体α7-nAChR蛋白表达量

烟碱型乙酰胆碱受体（Nicotinic acetylcholine receptors，AChRs）广泛分布于大脑海马中，作为乙酰胆碱的主要代谢型受体蛋白，ACh经过突触前膜胞吐作用于突触后膜，激活α7-nAChR可诱导多种与神经保护和突触可塑性相关的途径，促进海马神经元的增殖与分化，增强神经元突触可塑性[40]。研究认为在AD发病早期出现Aβ沉积，认知障碍临床表现变得明显之前，烟碱型乙酰胆碱受体，尤其是α7亚型，在与认知和记忆功能相关的脑区表达异常[41]。有强有力的证据表明，通过激活α7胆碱能受体能够使患者的学习记忆功能得到一定改善，它与AD早期学习和记忆能力的降低密切相关[42]。

实验2.2发现党参-茯苓-甘草水提物能够调节学习记忆障碍小鼠海马中ACh水平，则位于突触后膜上的ACh受体表达量也会随之降低。通过检测各组小鼠海马中α7-nAChR的蛋白表达量，发现模型组小鼠与正常组相比，α7-nAChR蛋白表达量显著降低（0.73 vs.1.00，p<0.01）；高剂量党参-茯苓-甘草组（40 g/kg）小鼠与模型组相比，蛋白表达量有升高趋势（1.01 vs.0.73，p<0.01），但低剂量和中剂量党参-茯苓-甘草组（10 g/kg、20 g/kg）无显著差异（1.01 vs. 0.73，p>0.05；0.66 vs. 0.73，p>0.05）。课题组通过对党参、茯苓、甘草三味中药治疗阿尔茨海默病的药物-疾病靶点网络药理学分析，预测到靶点α7-nAChR（Gene name:CHRNA7）是具有相关性的目的蛋白之一[43]。此外，未小明等[44,45]认为中药活性成分或水提物若促进AD模型α7-nAChR蛋白的表达，则能证实其具有一定改善学习记忆的效果。所以，可判断党参-茯苓-甘草水提物能够激活学习记忆障碍小鼠海马中α7-nAChR，起到改善学习记忆障碍的作用。

图2 党参-茯苓-甘草水提物对小鼠海马乙酰胆碱受体α7-nAChR蛋白表达的影响Fig.2 Effect of water extract on expression of α7-nAChR protein in mouse hippocampus (mean±SD, n=3)

2.4.2 钙离子相关蛋白CaMK Ⅱ

α7胆碱能受体（α7-nAChR）作为离子型通道，对Ca2+有很好的通透性，能协助第2信使Ca2+，参与调节学习记忆[46]。研究表明，突触神经元Ca2+浓度的变化均影响长时程增强（Long-term potentiation，LTP）的诱导与维持，其中研究最为深入，且具有关键作用的相关蛋白激酶中，不得不提的是钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependentprotein kinaseⅡ，CaMK Ⅱ）[47,48]。Ca2+内流能够激活CaMK Ⅱ，促使其发生自身磷酸化，据此早在1994年，Lisman[49]推测CaMK Ⅱ可能是记忆的分子基础。在敲除CaMKⅡα亚基后发现小鼠的空间学习记忆能力显著降低，但非空间记忆能力无显著变化，海马作为空间学习与记忆的生物基础，所以本研究对小鼠海马中CaMK Ⅱ的蛋白磷酸化表达量测定[50]。

ACh含量的降低，使其受体α7-nAChR蛋白活性下降，Ca2+浓度也随之降低，所以与正常组相比，模型组小鼠海马组织中CaMK Ⅱ的蛋白磷酸化表达量显著降低（0.66 vs. 1.00，p<0.01）；与模型组相比，中剂量和高剂量党参-茯苓-甘草组（20 g/kg、40 g/kg）小鼠海马中CaMK Ⅱ的蛋白磷酸化表达量显著升高（0.91 vs. 0.66，p<0.05；1.01 vs. 0.66，p<0.01），低剂量党参-茯苓-甘草组（10 g/kg）无显著差异（0.65 vs.0.66，p>0.05）。不过，在本课题组前期的研究中，学习记忆障碍小鼠海马中CaMK Ⅱ出现过表达现象，与本研究结果相反[51]。不过，前期研究是基于乙醇诱导兴奋性毒性，受体活性增强引起了钙超载现象；而本研究是基于东莨菪碱诱导ACh含量下降，其受体活性减弱引起的钙离子浓度降低现象。所以，CaMK Ⅱ的表达异常，即过表达或低表达，均能够对学习记忆能力产生损伤。Kanno等[52]研究认为通过上调CaMK Ⅱ的磷酸化表达量，能够起到显著的改善记忆障碍的作用，本研究得到相似的结果。

图3 党参-茯苓-甘草水提物对小鼠海马CaMK Ⅱ蛋白表达的影响Fig.3 Effect of water extract on expression of CaMK Ⅱ protein in mouse hippocampus (mean±SD, n=3)

2.4.3 突触可塑性相关蛋白ERK和CREB

胞外信号调节激酶（extracelluar signal-regulated kinase，ERK）和环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是与学习记忆相关的蛋白，对调节突触可塑性起到重要作用，并参与胆碱能突触通路[53]。ERK级联的激活需要CaMK Ⅱ等突触蛋白的激活，ERK包括ERK1和ERK2，其磷酸化（phosphorylation-ERK，p-ERK）在神经元细胞增殖、抑制细胞凋亡中发挥重要调节作用[54,55]。CREB是海马突触可塑性和海马依赖记忆的关键核转录因子，其磷酸化（phosphorylation-CREB，p-CREB）是海马空间记忆形成的分子标记[56]。多数研究发现，CaMK II磷酸化转录因子CREB，并将其转化为活性形式p-CREB，随后启动神经元可塑性所需的蛋白质的转录和翻译[57-59]。研究表明AD动物海马组织中p-ERK与p-CREB蛋白表达均普遍降低，通过激活ERK与CREB磷酸化能够增强小鼠学习记忆能力[60]。

图4 党参-茯苓-甘草水提物对小鼠海马突触可塑性蛋白ERK和CREB表达的影响Fig.4 Effect of water extract on expression of ERK and CREB proteins in mouse hippocampus (mean±SD, n=3)

本研究对ERK1/2以及CREB的磷酸化水平进行测定后发现，与正常组相比，模型组小鼠海马组织中ERK1/2及CREB的磷酸化蛋白表达量显著降低（0.64 vs. 1.00，p<0.01；0.52 vs. 1.00，p<0.01）；与模型组相比，中剂量和高剂量党参-茯苓-甘草组（20、40 g/kg）小鼠海马中p-ERK1/2蛋白磷酸化表达量显著升高（0.85 vs. 0.64，p<0.01；1.01 vs. 0.64，p<0.01），p-CREB蛋白磷酸化表达量也显著升高（0.75 vs. 0.52，p<0.05；0.79 vs. 0.52，p<0.01）；低剂量党参-茯苓-甘草组（10 g/kg）有升高趋势，但效果不显著（0.77 vs. 0.64，p>0.05；0.52 vs. 0.52，p>0.05）。上述结果表明，模型组小鼠海马中ACh水平的降低，使突触后膜乙酰胆碱受体α7-nAChR活性降低，从而引起该信号通路相关蛋白p-ERK1/2及p-CREB处于低表达状态[61]；党参-茯苓-甘草能够升高模型鼠海马中ACh水平，恢复α7-nAChR蛋白活性，激活胆碱能突触信号通路，对该通路中相关蛋白p-ERK1/2及p-CREB表达起到上调作用，得到与屈夏夏等[60]和高静等[62]相同的研究结论。

3 结论

本研究通过Morris水迷宫测试，分析小鼠穿越原平台的次数、在第Ⅲ象限停留时间及第Ⅲ象限运动路程，发现不同剂量党参-茯苓-甘草对学习记忆障碍小鼠的学习记忆能力均有不同程度的改善，以40 g/kg剂量表现最佳。党参-茯苓-甘草水提物20、40 g/kg剂量能够降低氢溴酸东莨菪碱导致的学习记忆障碍小鼠海马AChE酶活，从而升高ACh的水平，以及上调α7-nAChR与CaMKⅡ蛋白表达量。此外，党参-茯苓-甘草水提物20、40 g/kg剂量均能够上调p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达。说明党参-茯苓-甘草水提物能够降低海马组织AChE活性，升高ACh水平，恢复乙酰胆碱受体α7-nAChR活性，上调相关蛋白CaMKⅡ、p-ERK1/2、p-CREB的表达。党参-茯苓-甘草水提物能够改善小鼠的学习记忆障碍，其机制可能与降低海马组织AChE活性，升高ACh水平，恢复ACh受体α7-nAChR蛋白活性，激活胆碱能突触通路并上调相关蛋白的表达有关。结合杨鹏飞等[14]对水提物的抗氧化及增强免疫力研究，本研究为今后潞党参、茯苓、甘草多靶点预防疾病提供了实验基础，更为“药食两用”中药资源保健功能的开发提供研究方向。