低锌饲粮中添加载锌蒙脱石对肉鸡组织微量元素含量、肝脏酶活性及空肠锌转运蛋白基因表达的影响

秦士贞 王海波 武真邑 龚莉媛 裴文刚 车育彦 杨敏敏 史兆国

(甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070)

锌源直接影响组织中锌、铜、铁、锰等微量元素的吸收和机体正常代谢功能。锌在肠道转运过程中通过金属硫蛋白(MT)、锌转运蛋白(ZnT)、转铁蛋白家族中的二价阳离子转运蛋白1(DMT1)和调控锌转运蛋白的金属效应元件结合转录因子-1(MTF-1)共同参与肠道对锌等二价离子的转运，共同作用下调节机体内锌的动态平衡[1]。Bao等[2]在研究肉鸡饲粮中微量元素的交互作用时发现，在锌、铁、锰和铜4种元素中，锌是第一限制性元素，锌缺乏时会阻碍铁、锰和铜的吸收；且锌参与机体酶和功能蛋白的组成密切相关，并介导肠道离子转运，促进绒毛发育[3-4]。但锌的吸收利用容易受饲料原料(螯合物、蛋白质、微量元素)、动物品种、锌存在形式的影响。饲料锌源常采用的无机锌易吸潮结块破坏饲粮中的维生素及其他活性营养物质[5]。在正常条件下，摄入锌的94%会被排出体外，只有6%会在体内积累[6]，利用率低。

蒙脱石、沸石等具有表面积大、吸附能力强、阳离子交换和黏附能力高的特征，通过金属元素的富集和离子对其改性后，能提高金属元素的利用率[7]，使其在动物肠道内合理释放，减少微量元素对环境的污染，并结合毒素、细菌和病毒，减少肠道损伤，保护肠道健康[8-9]。秦士贞等[10]研究发现，饲粮中添加载锌蒙脱石(Zn-MMT)能显著提高小肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度，降低小肠隐窝深度。目前关于Zn-MMT对肉鸡组织金属元素含量、含锌酶活性的研究报道较少，可以通过组织中锌的含量及肝脏含锌碱性磷酸酶活性来评价机体锌的营养状况[11]。因此，本试验拟在玉米-豆粕型基础饲粮(低锌饲粮)中添加Zn-MMT，研究其对肉仔鸡组织矿物元素含量、肝脏含锌酶活性及肠道锌转运蛋白基因表达影响的研究，为Zn-MMT的合理利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用Zn-MMT(赤峰某生化工有限公司提供)，经兰州中检科测试技术有限公司检测，其中锌含量为10 408.80 mg/kg 。

1.2 试验设计

采用单因子完全随机试验设计，选择1日龄健康科宝公雏240只，按体重一致原则随机分成5组，每组6个重复，每个重复8只鸡。对照组饲喂基础饲粮(低锌饲粮)，4个试验组分别在低锌饲粮中添加20、40、60和80 mg/kg Zn-MMT (均以锌含量计算)替代预混料的载体，试验期为42 d。

1.3 试验动物及管理

试验于2019年10月26日—2019年12月7日在甘肃农业大学动物科学技术学院实训中心进行，试验肉鸡采用3层笼养，饲养管理和常规免疫按照《科宝肉仔鸡饲养管理手册》进行，采用24 h恒定光照，鸡只自由采食、饮水。

1.4 基础饲粮

基础饲粮参照T/CFIAS 002—2018《蛋鸡、肉鸡配合饲料》和NRC(1994)配制，为玉米-豆粕型粉料，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items1～21日龄 1 to 21 days of age22～42日龄 22 to 42 days of age营养水平 Nutrient levels4)代谢能 ME/(MJ/kg)12.4813.05粗蛋白质 CP20.0118.60钙 Ca1.261.02有效磷 AP0.500.41赖氨酸 Lys1.251.12蛋氨酸 Met0.510.50蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.880.86锌 Zn/(mg/kg)5)27.6227.08

1.5 指标测定与方法

分别于肉鸡21和42日龄，每重复随机选取1只接近平均体重的肉鸡进行屠宰，测定组织微量元素含量、肝脏抗氧化能力及含锌酶活性及42日龄空肠锌转运蛋白的表达。

1.5.1 微量元素含量的测定

快速采集胸肌、腿肌、肝脏、胰腺、胫骨、全血，并-20 ℃冰箱保存至分析。参考NY/T 3318—2018标准，准确称取组织3～5 g放入30 mL的坩埚中，缓慢加热炭化至无烟后，将其转入550 ℃高温炉中灰化，直至样品变成灰白色，加2 mL的超纯水和10 mL 50%的硝酸溶液溶解蒸干，随后采用5 mL 50%的硝酸溶液加热溶解残渣，经超纯水将其转移至50 mL的容量瓶冷却定容，经定量滤纸过滤，采用Agilent Technologies 200 series AA火焰原子吸收仪测定组织中的铁、锰、锌、铜含量。

1.5.2 肝脏抗氧化能力及含锌酶活性或含量的测定

采集肝脏组织，经液氮速冻后，在-80 ℃冰箱中保存直至分析，并送甘肃硕联生物技术有限公司，采用上海酶联生物科技有限公司提供的试剂盒测定肝脏的丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)，铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，碱性磷酸酶(ALP)、苹果酸脱氢酶(MDH)活性。

1.5.3 肉鸡42日龄空肠锌转运蛋白基因表达的测定

表2 目的基因及内参基因引物

1.6 数据统计分析

数据经Excel 2013处理后，采用SPSS 26.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan氏法进行多重比较，试验结果以“平均值±标准差(SD)”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织微量元素含量的影响

2.1.1 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织铁元素含量的影响

由表3可知，低锌饲粮添加Zn-MMT可显著影响21日龄胫骨和42日龄胰腺及全血中铁的含量(P<0.05)，但对21日龄胸肌、腿肌、肝脏、胰腺、全血及42日龄的胸肌、腿肌、肝脏、胫骨中铁含量均无显著影响(P>0.05)。相比CK组，低锌饲粮添加Zn-MMT显著降低21日龄胫骨中铁的含量(P<0.05)，同时添加60和80 mg/kg的Zn-MMT显著降低42日龄胰腺中铁的含量(P<0.05)，添加40 mg/kg的Zn-MMT显著提高42日龄全血中铁的含量(P<0.05)。但对21日龄胸肌、腿肌、肝脏、胰腺、全血及42日龄的胸肌、腿肌、肝脏、胫骨中铁含量均无显著影响(P>0.05)。

2.1.2 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织锰元素含量的影响

由表4可知，低锌饲粮添加Zn-MMT对21日龄胸肌、腿肌、肝脏、胫骨和全血及42日龄肝脏及全血中锰的含量无显著影响(P>0.05)，但显著影响21日龄胰腺和42日龄胸肌、腿肌、胫骨及胰腺中锰的含量(P<0.05)。相比CK组，低锌饲粮添加40、60和80 mg/kg的Zn-MMT显著提高21日龄胰腺中锰的含量(P<0.05)，但显著降低42日龄胫骨和胰腺中锰的含量(P<0.05)。且添加40 mg/kg的Zn-MMT显著提高42日龄胸肌和腿肌中锰的含量(P<0.05)。

2.1.3 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织铜元素含量的影响

由表5可知，低锌饲粮添加Zn-MMT对21日龄腿肌、肝脏、胫骨、胰腺和全血及42日龄腿肌、肝脏、胫骨和全血中铜的含量无显著影响(P>0.05)，但显著影响21和42日龄胸肌及42日龄胰腺中铜的含量(P<0.05)。相比CK组，低锌饲粮添加20 mg/kg的Zn-MMT显著提高21日龄胸肌中铜的含量(P<0.05)；添加40和60 mg/kg的Zn-MMT能显著提高42日龄胸肌中铜的含量(P<0.05)，但是添加80 mg/kg的Zn-MMT显著降低胰腺中铜的含量(P<0.05)。

表3 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织铁元素含量的影响

表4 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织锰元素含量的影响

表5 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织铜元素含量的影响

2.1.4 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织锌元素含量的影响

由表6可知，低锌饲粮添加Zn-MMT对21日龄胸肌、腿肌及42日龄腿肌中锌的含量无显著影响(P>0.05)，但显著影响21和42日龄肝脏、胫骨、胰腺、全血及42日龄胸肌重锌的含量(P<0.05)。相比CK组，低锌饲粮添加Zn-MMT对21日龄胸肌中锌元素无显著影响(P>0.05)，且显著提高42日龄胫骨及21日龄全血中锌元素的含量(P<0.05)，但添加60和80 mg/kg的Zn-MMT显著降低42日龄胸肌中锌元素的含量(P<0.05)，显著提高21和42日龄胰腺中锌的含量及21日龄肝脏中锌含量(P<0.05)。低锌饲粮添加Zn-MMT对21和42日龄的腿肌中锌含量无显著影响(P>0.05)。低锌饲粮添加40、60和80 mg/kg的Zn-MMT显著增加42日龄肝脏及21日龄胫骨中锌的含量(P<0.05)，同时添加40和80 mg/kg的Zn-MMT显著增加42日龄全血中锌元素的含量(P<0.05)。

表6 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织锌元素含量的影响

2.2 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡肝脏含锌酶活性或含量和抗氧化能力的影响

由表7可知，低锌饲粮添加Zn-MMT对21及42日龄肉鸡肝脏ALP、MDH活性，LDH、 CuZn-SOD含量，MDA含量及T-AOC均无显著影响(P>0.05)。

表7 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡肝脏含锌酶活性或含量和抗氧化能力的影响

2.3 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡空肠锌转运蛋白基因表达的影响

由表8可知，低锌饲粮添加载锌蒙脱石显著影响肉鸡空肠DMT1、MT、MT3、锌转运载体-2(ZnT-2)、锌转运载体-5(ZnT-5)的基因相对表达量(P<0.05)，但对金属效应元件结合转录因子-1(MTF-1)基因相对表达量无显著的影响(P>0.05)。相比CK组，添加Zn-MMT显著提高空肠ZnT-5基因相对表达量(P<0.05)，但对MTF-1基因相对表达量无显著影响(P>0.05)。且添加20和40 mg/kg的Zn-MMT显著提高空肠DMT1基因相对表达量(P<0.05)。添加40、60和80 mg/kg的Zn-MMT显著提高空肠MT3基因相对表达量(P<0.05)，且同时添加60和80 mg/kg的Zn-MMT显著提高空肠MT、ZnT-2基因相对表达量(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡组织微量元素含量的影响

锌作为肉鸡生长发育过程中必需微量元素，参与调节机体酶和功能蛋白密活性，并对组织中锌、铜、铁、锰等微量元素的吸收和机体正常代谢功能密切相关，在饲粮锌缺乏时会阻碍铁、锰和铜在机体的利用[2,15-16]。其中，骨锌含量是家禽锌利用最敏感参数[11]；胰腺是对饲粮锌含量最敏感的组织[17]，为评价肉仔鸡锌需要量的重要指标。同时，肝脏作为主要的矿物质储存和锌周转代谢速率最快的器官[6]，与胰腺、胫骨、血液共同反映机体锌营养水平。秦士贞等[10]在本试验前期的研究中发现，低锌饲粮中添加Zn-MMT对全期肉鸡生长性能、胸肌率、腿肌率均无显著影响。对于前期肠道系统尚未发育完整、消化酶分泌不足的幼雏，由于Zn-MMT特殊的结构和理化特性，在肠道中吸附有害物质的同时吸附其他营养，对前期生长性能产生不利影响，当添加量超过60 mg/kg时，降低肉鸡1～21日龄的平均日增重。然而，Zn-MMT又能使锌在动物肠道内合理释放，提高锌的生物学效率[7-8]，促进肠绒毛发育，维持肉鸡肠道结构完整性，促进肉鸡肠道发育[10]。Li等[6]的研究发现，载锌硅酸盐具有良好的生物利用，并能增强锌转运相关蛋白在蛋鸡空肠的表达，促进锌的转运吸收。Ao等[18]研究发现，饲粮中添加锌可以增加胫骨和血液中锌含量，同时含锌坡缕石可提高肉仔鸡胫骨和血液中锌含量[19]。同时，闫素梅等[20]研究结果表明，饲粮锌水平在47.61～87.61 mg/kg时，肉仔鸡肝脏与胫骨的锌含量相对

稳定。本试验研究结果显示，低锌饲粮添加Zn-MMT显著提高21日龄血液中锌的含量，且添加60和80 mg/kg Zn-MMT显著提高肝脏、胰腺中锌含量，其含量达到40 mg/kg能显著提高胫骨中锌含量。这与杨雪[16]研究发现载锌硅酸盐黏土对肉鸡肝脏、胫骨、胰腺锌沉积的结果相似。各种矿物元素在机体内作用关系错综复杂，相互影响，表现为协同与拮抗作用。由于锌与铜化学性质相似，铜、锌之间适当的配比具有协同作用，反之发生颉颃作用[21]。刘雨龙等[22]研究发现，鸡组织和器官中铜的含量随着饲粮锌添加量的提高呈下降趋势。本试验结果表明，低锌饲粮添加80 mg/kg的Zn-MMT显著降低肉鸡前期胸肌和胫骨及后期胰腺中铜、铁、锰的含量，且添加20 mg/kg的Zn-MMT显著提高前期胸肌中的铜含量，添加40 mg/kg的Zn-MMT显著提高后期胸肌与全血中的铜含量，及后期胸肌、腿肌中锰的含量，这与杨伟丽[23]发现的20和40 mg/kg的载锌硅酸盐黏土可促进鸡肉中的铜沉积结果相似。这可能和锌、铁、铜、锰等二价金属元素会竞争结合配体和共同的代谢渠道有关[24]及组织对锌的敏感性、代谢强度及锌离子的释放有关。

表8 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡空肠锌转运蛋白基因表达量的影响

3.2 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡肝脏含锌酶活性或含量及抗氧化功能的影响

正常生理环境下，机体主要靠内源性酶系和非酶系的维生素、微量元素及外源性矿物质、中草药等抗氧化剂共同维持体内自由基的动态平衡。适量补锌可影响动物体内CuZn-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)活性和MT表达，保护动物体免受自由基损伤，增强机体抗氧化能力[25]。饲粮锌摄入量直接影响动物组织器官中锌酶的活性，从而影响机体相关代谢活动，其最具有代表性的为抗氧化酶防御系统中CuZn-SOD和糖代谢中的ALP活性变化，在一定范围内ALP和LDH活性与饲粮中锌含量呈正相关[13,26]。同时，沸石能够在一定程度上提高ALP活性[27]，且载锌沸石提高肝脏ALP、LDH、MDH活性，但缺锌可引起肝脏CuZn-SOD活性下降,适量补锌可恢复[28]。同时，黄艳玲等[29]、蒋宗勇等[30]研究发现，饲粮锌水平对肝脏CuZn-SOD活性无显著影响，但载锌沸石可提高肉鸡肝脏[13]、空肠[31]中CuZn-SOD活性，降低胸肌、腿肌中的MDA含量，提高T-AOC[16]。在本试验中，饲粮中添加Zn-MMT对21及42日龄肉鸡肝脏ALP、MDH活性，LDH、CuZn-SOD含量，MDA含量及T-AOC均无显著影响。这与马芳[32]研究发现的不同锌水平对肉鸡42日龄ALP、LDH活性无显著影响的结果相似。但李林枫[26]在蛋鸡中的研究结果出现差异。这可能是因为基础饲粮中的锌水平已经能够满足肉鸡机体ALP、LDH、MDH、CuZn-SOD发挥正常功能。同时，刘泽辉[33]报道发现，饲粮锌水平对肉鸡肝脏MDH活性无显著影响；且Zn-MMT吸附氧自由基，并其进入胃肠道后可以延缓锌离子在肉鸡肠黏膜中的作用时间，充分发挥锌的生物学功能，保持机体正常代谢中产生的自由基处于动态平衡，维持机体免受氧化应激[13]。

3.3 低锌饲粮添加Zn-MMT对肉鸡空肠锌转运蛋白基因表达的影响

锌广泛分布于动物体内，家禽主要经小肠进行吸收，部分经腺胃吸收[22]，共同参与体内300多种酶或蛋白的构成和活性功能、养分和遗传物质代谢，介导肠道离子转运，维持其稳态[3-4,10]。这种平衡状态主要由锌转运体(ZnT/SLC30A家族)、锌铁调控蛋白(ZIP/SLC39A家族)、MT和MTF-1这4类锌指蛋白协调调控[34]，参与锌的摄取、排泄、储存和运输全过程[6]。锌通过MTF-1调控MT和ZnT维持机体锌动态平衡，但不同ZnT的表达对饲粮锌的敏感程度存在差异。在大鼠的试验中发现，ZnT2对饲粮锌反应最敏感[35]。在大鼠[36]、断奶仔猪[37]及肉鸡[38]的研究中发现MT的表达随着锌添加量的增加而增加，同时载锌沸石可以提高蛋鸡[35]和肉鸡[12]锌转运体蛋白的表达。本试验研究发现，Zn-MMT未能显著提高肉鸡空肠MTF1基因相对表达量，这与Li等[6]在蛋鸡中添加载锌沸石的研究结果相同。但添加Zn-MMT显著提高肉鸡空肠ZnT5基因相对表达量，且20和40 mg/kg的Zn-MMT显著提高肉鸡空肠DMT1基因相对表达量。同时，60和80 mg/kg的Zn-MMT显著提高肉鸡空肠ZnT2、MT、MT3基因相对表达量。Zn-MMT的缓释功能使其在肠道中缓慢释放出锌离子，增加锌转运蛋白表达，提高锌离子的利用率，且Zn-MMT具有硅酸盐矿物和锌各自的生物学功能，能够提高机体免疫力，改善胃肠道状况[10,39]，为营养物质的吸收创造良好的环境，从而促进锌的吸收。

4 结 论

低锌饲粮添加40 mg/kg的Zn-MMT，能显著提高42日龄肉鸡空肠DMT1、MT3、ZnT-5转运体蛋白基因的表达，并提高肝脏、胫骨中锌的含量和全血中的铁、铜、锌及腿肌中锰和胸肌锰、铜的含量，且锌在肝脏、胫骨、胰腺、全血中的含量随着Zn-MMT添加量的增加而增加，从而影响铁、锰、铜在组织中的含量。