基于网络药理学探讨桑贝止嗽散治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制*

龙远雄，欧阳林旗，房 赤，彭 俊，王胜玫，陈 镇，陈新宇，邓桂明

湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007

新型冠状病毒肺炎新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）（简称新冠肺炎）［1］是一种经呼吸道传播的新型传染病，目前临床上尚未发现特效治疗药物。中医将其归属为“疫病”范畴［2］，国医大师熊继柏认为此次新冠肺炎属于温热浊毒之疠气引起的疫病，并将病程分为轻症期、重症期、危重期、恢复期，在其牵头制定的《湖南省新型冠状病毒感染的肺炎中医药诊疗方案（试行）第三版》中，推荐使用桑贝止嗽散、桑菊饮、银翘散、霍朴夏苓汤方剂治疗新冠肺炎不同时期患者。其中桑贝止嗽散主要用于初热期咳嗽微喘型患者的治疗，组方为桑贝散合止嗽散，药物组成：桑白皮、浙贝母、百部、紫菀、白前、桔梗、荆芥、陈皮、苦杏仁、甘草，本方中百部、紫菀为原止嗽散两味君药，桑白皮、浙贝母为桑贝散的核心药对［3-5］。本研究通过网络药理学的方法筛选桑贝止嗽散中4味核心药物的有效成分，运用TCMSP、GeneCards等数据库收集其治疗新冠肺炎的相关靶点，构建“活性成分-靶点”和蛋白互作网络，分析其作用功能通路，为进一步开展桑贝止嗽散药理机理和临床推广提供依据。

1 资料与方法

1.1 桑贝止嗽散核心药物活性化合物提取筛选本研究通过中药网络药理学平台检索桑白皮、浙贝母、百部、紫菀四味核心药物的化学成分，并以口服吸收利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18为筛选条件，提取各味中药的主要活性化合物。

1.2 桑贝止嗽散核心药物治疗新型冠状病毒肺炎靶点预测利用TCMSP数据库通过化合物MOL-ID编号检索其作用靶标，并通过Uniport数据库检索各靶点对应的基因名；基于GeneCards数据库，以“viral pneumonia”为关键词检索与新型冠状病毒肺炎相关的基因，并与药物活性化合物靶点取交集，得到桑贝止嗽散核心药物治疗新冠肺炎的作用靶点。

1.3 “活性化合物-作用靶点”网络构建与分析将

桑贝止嗽散核心药物活性化合物及其作用于新冠肺炎的相关靶点导入Cytoscape3.7.1软件中，并利用“Network Analyzer”功能对中药化学成分-作用靶点网络进行分析。根据化合物与靶点连接情况筛选出桑贝止嗽散核心药物对作用于新冠肺炎的关键化合物。

1.4 蛋白互作（protein protein interaction，PPI）网络构建及关键靶点筛选将交集靶点导入STING数据库中，限定研究物种为人类，得到桑贝止嗽散核心药物作用于新冠肺炎的PPI网络。借助Cytoscape软件对网络进行拓扑分析，选取度（Degree），介数（betweenness）和中心性（closeness）都大于平均值的靶点为关键靶点。度（degree）值为某节点直接相连的节点数，值越大，说明与其发生关联的节点越多，该节点越重要；介度（betweenness）指的是图中有路径相连的两个节点这样的边中有多少条边经过本节点；中心性（closeness）计算的是节点处于图中间位置的程度。这三个值共同决定某节点关键程度，值越大，越关键。

1.5 靶点GO功能分析KEGG通路分析为进一步了解核心靶点基因功能和桑贝止嗽散核心药物治疗新冠肺炎的主要作用通路，将药物与疾病相关靶点输入DAVID数据库，选定物种为“homo sapiens”，设定阈值P＜0.05进行GO和KEGG分析，用R语言进行可视化处理。

2 结果

2.1 桑贝止嗽散核心药物主要活性化合物及对应靶标本研究通过TCMSP平台检索桑贝止嗽散4味君药包含的主要化合物，依据OB≥30%，DL≥0.18共筛选出主要活性化合物82个，其中桑白皮24个、浙贝母7个、百部32个、紫菀19个。去掉重复值后共78个活性化合物，再通过各化合物molecule-ID寻找对相应的靶点，得到各药物靶点总数997个，去重后靶点数148个靶点。

2.2 桑贝止嗽散核心药物治疗新型冠状病毒肺炎疾病靶点预测在Genecards数据库中以“viral pneumonia”作为关键词进行检索，得到与新型冠状病毒肺炎相关的基因，将筛选得到的药物靶点与疾病靶点进行映射，获得桑贝止嗽散核心药物治疗新冠肺炎的潜在作用靶点。通过数据库收集整理得到的新冠肺炎疾病相关基因共有3473个，通过与桑贝止嗽散核心药物活性化合物的潜在靶标取交集分析后，共发现87个桑贝止嗽散核心药物靶点与新冠肺炎疾病相关，交集靶点见表1。

表1 桑贝止嗽散治疗新型冠状病毒肺炎疾病靶点

2.3 活性化合物-疾病靶点网络构建与分析在桑贝止嗽散4味核心药物78个有效化合物中作用的靶点中，通过与GeneCards数据库中3473个新冠肺炎相关靶基因进行比对，其中交集基因数87个，对应有效化合物68个，借助软件Cytocsape 3.7.1构建中药化合物-靶点网络，见图1。图1中，红色矩形代表有效成分节点，绿色菱形代表靶点节点，形状越大，表示度（degree）越大。

图1 中1度（degree）≥20的化合物共8个，度数最高的化合物为quercetin，其次为kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、Stigmasterol、7-methoxy-3-methyl-2，5-dihydroxy-9，10-dihydrophenanthrene、formononetin、isorhamnetin，这些度值较高的化合物可能是桑贝止嗽散核心药物治疗新冠肺炎的关键化合物。见表2。

表2 桑贝止嗽散核心治疗药物与新冠肺炎关键化合物（Degree≥20）

图1 有效化合物-作用靶点图

2.4 蛋白互作（PPI）网络构建与关键靶点筛选将药物-疾病交集靶点（87个）Cytoscape软件进行拓扑分析，选取自由度（Degree），介数（Betweenness）和中心性（Closeness）都大于平均值的靶点为关键靶点。网络中各节点的平均自由度为18.96，平均介数为88.51，平均中心度数为0.51，自由度、介数、中心度数均超过平均值的靶点有17个，见表3。推测这些靶点可能是桑贝止嗽散治疗新冠肺炎的关键靶。同时将结果导入STRING数据库进行蛋白相互作用（PPI）分析，限定研究物种为“人”，得到桑贝止嗽散核心药物用于新冠肺炎的PPI网络，见图2。

表3 桑贝止嗽散核心药物治疗新型冠状病毒肺炎疾病的关键靶点

图2 PPI蛋白互作网络图

2.5 GO功能富集分析将药物-疾病交集基因导入DAVID6.8数据库，输入靶基因名称列表，限定物种为“Homo Sapiens”，设定阈值P＜0.05，进行GO功能分析和基于KEGG通路富集分析。结果显示87个基因共影响110个生物学过程（其中生物进程BP 67个，细胞组分过程CC17个，分子功能过程MF26个），富集显著程度排名前15的生物过程见表4，表中PValue值越小，表示富集程度越显著，用R软件进行可视化展示，见图3。

表4 靶点GO分析结果（部分）

图3 靶点GO富集分析柱状图

2.6 KEEG通路分析87个交集靶点基因富集于14条通路上（P＜0.05，FDR＜0.05），其中有5条通路新型冠状病毒肺炎密切相关，见表5。主要包括PI3K-Akt信号通路，钙离子信号通路，T细胞受体信号转导，TNF信号通路，VEGF信号通路，提示桑贝止嗽散核心药物可能通过作用以上多条通路来发挥治疗（初热期咳嗽微喘型）新冠肺炎作用机制。

表5 靶点KEGG分析结果

3 讨论

新冠肺炎因其传染性强、传播迅速，归属于中医“疫病”范畴，患者为感受疫疠之气，病位在肺，病性特点为“湿热浊毒”，事实证明中医药对其有较好的治疗效果［6］。桑贝止嗽散作为宣肺止咳的良药，被《湖南省新型冠状病毒感染的肺炎中医药中医药诊疗方案（试行第三版）》推荐使用，主要治疗新冠肺炎发热初期咳嗽微喘型患者。该方主要由止嗽散和桑贝散组成，方中桑白皮和贝母具有平喘功效，紫菀、百部可止咳化痰，诸药相配，共奏止嗽化痰，宣肺平喘之功［5］。

本研究基于网络药理学原理共筛选桑贝止嗽散中4味核心药物（桑白皮、紫菀、浙贝母、百部）活性化合物78个，作用靶点148个，其中作用于新冠肺炎的有效化合物68个、靶点87个，说明桑贝止嗽散治疗新冠肺炎具有多成分、多靶点的特点。通过“活性化合物-靶点”网络进行分析，筛选出Degree≥20的关键活性化合物8个。度值最大的为槲皮素，槲皮素本身具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理作用，能有效改善肺损伤情况，同时也能降低TGF-β1、TNF-α和α-SMA活性、抑制细胞凋亡及降低细胞炎症因子释放，从而抑制细胞凋亡降低炎症水平［7-8］；山奈酚是MHF的主要活性成分，与槲皮素能够与2019-nCoV3CL水解酶、ACE2完成较好的对接，从而起到治疗的效果［9］；木犀草素是一种黄酮类化合物，临床主要用于消炎止咳、祛痰平喘等，具有消炎、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用，能通过免疫调节抑制大肠埃希菌（导致肺炎的常见菌株）对呼吸道上皮细胞的感染［10-11］；β-谷甾醇和豆甾醇是常见的植物甾醇，两者均具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤和调节中枢神经系统的作用［12］；芒柄花素是一种能治疗肺炎、调节机体免疫功能的活性成分，可以通过结合人体ACE2受体阻断病毒的入侵，具有潜在抗SARSCoV-2活性［13］；7-甲氧基-3-甲基-2，5-二羟基-9，10-二氢菲能够作用于ADRB2、AR、CCNA2等23个与新冠肺炎相关的靶标，从而达到治疗目的；异鼠李碱能够通过MAPK和NF-KB的信号通路对LPS诱发的急性肺损伤起保护性的作用［14-15］。

蛋白互作（PPI）网络中筛选后，Degree＞40的靶点有9个：肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血 管 内 皮 生 长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、细胞肿瘤抗原（tumor protein p53，TP53）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、JUN激酶（Jun kinase，JUN）、前列素内环氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）、丝裂原活化蛋白激酶8（recombinant mitogen activated protein kinase 8，MAPK8）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）。TNF在维持细胞、组织和生物体内的稳态方面起着重要作用，参与机体炎症反应与免疫反应，可以调节炎症反应［16］。VEGFA具有改善血管通透性、促进血管内皮细胞分裂的作用。有研宄表明VEGFA基因与肺癌的发病风险具有相关性［17］。TP53是一种抑癌基因，其关键功能是修复DNA损伤，在调控细胞周期、细胞凋亡和维持基因组稳定的过程中发挥着重要作用，与非小细胞肺癌密切相关［18］。EGF能促进多种组织的表皮细胞增殖、分化和修复，对促进高血压和肺血管病变的发生、发展发挥重要作用。JUN能够促使MAPK（蛋白激酶）发生信号转导级联反应，调节特定的基因表达，参与细胞凋亡，对急性炎症反应具有调节作用［19］。研究表明，PTGS2在影响RNA病毒的复制以及在治疗肺炎的过程中起关键作用。MAPK1和MAPK8属MAPK家族，MAPK的通路亚家族包括细胞外信号调节蛋白激酶（ERK1/2）和p38等，它们参与细胞增殖、分化、凋亡和炎症。表皮生长因子受体（EGFR）信号传导的肺损伤会引起肺纤维化，而抑制EGFR信号反应可以防止SARS及其他呼吸道病毒感染肺部纤维化的反应，EGFR突变是非小细胞肺癌患者最常见的靶基因异常［18］。

GO功能富集分析结果表明，桑贝止嗽散作用于新冠肺炎的生物过程主要涉及蛋白表达、信号通路传导、炎症反应等110个，其中脂多糖介导的信号通路、细胞外间隙、蛋白信号转导、缺氧反应、基因表达的负调控、血红素结合等生物过程在治疗新冠肺炎中可能发挥关键作用。KEGG通路分析结果显示，桑贝止嗽散治疗新冠肺炎的潜在作用靶点主要涉及PI3K-Akt信号通路，钙离子信号通路，多巴胺能突触等6条，涵盖病毒、免疫调节、炎症等各个方面，通路上富集靶点越多，发挥的作用可能越大。本研究中PI3K-Akt信号通路富集靶点数最多，说明其作用最为关键，PI3K-Akt信号通路参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节，已有研究表明PI3K信号通路在调控重症肺Treg/Th17平衡中的能发挥重要作用［20-22］；其次富集靶点数较多通路还有钙离子信号通路、T细胞受体信号转导等，说明桑贝止嗽散可能通过作用于这些通路的相关靶点发挥治疗作用。

本研究通过网络药理学方法从理论分析得到桑贝止嗽散核心药物治疗新冠肺炎的关键化合物及其作用的潜在靶点、影响的生物功能过程和通路，同时也得出桑贝止嗽散治疗新冠肺炎是多成分、多靶点、多途径相互作用的结果，可以为临床提供理论依据，但其作用机制还需通过实验研究验证。