浓香型大曲菌系、酶系的研究进展

汪凌旭，易卓林，赵 海，黄 丹，罗惠波

（1. 四川轻化工大学生物工程学院，四川 宜宾 644000；2. 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；3. 中国科学院环境与应用微生物重点实验室，成都 610041；4. 环境微生物四川省重点实验室 成都 610041）

引 言

大曲是以小麦为主要原料制成的形状较大、含有丰富菌系和酶系的曲块，是酿酒用的糖化剂及发酵剂。大曲作为一种最古老的粗酶制剂，很早就被广泛应用于我国的酿酒行业。与西方纯菌液态发酵的蒸馏酒相比，大曲酒是由多种微生物固态发酵所制成的大曲为发酵剂，采用独特的边糖化边发酵的固态发酵工艺酿造而成。大曲独一无二的固态制曲和固态发酵工艺［1］，是它区别于国外所有蒸馏酒的关键。

大曲的制作工艺复杂，大致包括润麦、粉碎、拌料、成型、入室培菌、打拢以及入库贮存等步骤［2］。制曲过程中，大曲在开放条件下网罗自然界中的微生物。大曲中多种微生物混合生长，经协同和竞争发展，最终形成了稳定的特色菌系。大曲微生物生长的同时，还产生多种酶和代谢产物，使大曲成为3 种体系平衡的复合体。影响大曲平衡的因素有很多，原料、水分、pH、温度等因素都能影响微生物的生长以及酶和代谢产物的生成［3］。进一步研究证实，微生物的多样性及其所产功能酶的协同作用是形成白酒感官风味的关键，对大曲的好坏起决定性的作用，所以对大曲中菌系和酶系的研究显得尤为重要。大曲微生物的研究可分为培养方法与非培养方法两种。培养方法指无菌接种，分离培养大曲中的微生物菌种，并对其生理及代谢功能进行研究。该方法可为后续研究白酒的化学性质和形成机理提供基础数据。非培养方法主要是指聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）、454 焦磷酸测序、SOLiD 连接法测序、Illumina 合成测序（Solexa 测序、Hiseq 测序）以及宏基因组等组学技术。该方法能在完成大曲基因组学测序和注释的同时，一定程度上解析功能基因组，极大地促进了非培养微生物多样性及群落结构等研究的进展。大曲酶系的研究在初期主要集中于化学检测法和高效液相色谱法（HPLC）分析大曲粗酶液以及自大曲分离的纯菌所产粗酶的酶学性质，而后采用宏转录组等组学技术检测大曲酶系种类，以揭示大曲活跃微生物和酶谱。如今大曲酶系研究的难点主要体现在大曲宏转录组和宏蛋白组提取时容易降解、难以完全获取以及来源于大曲的酶基因在不同表达系统中实现异源表达得到纯酶两个方面。

大曲按其制曲温度可分高温大曲、中温大曲和低温大曲，代表曲分别是为酱香型大曲、浓香型大曲以及清香型大曲。目前浓香大曲酒占据了70% 白酒市场份额［4］，为当地经济的发展做出了重要的贡献。因此，本文将从菌系、酶系以及它们在大曲中的应用这3 个方面来阐述浓香型大曲的研究进展。

1 大曲微生物——菌系

浓香型白酒微生物的分离筛选始于20 世纪60 年代［5］，起初利用纯培养方法分离、筛选、鉴定浓香型大曲中的微生物菌种，并简单研究其生理代谢功能。随着技术的进步，又采用PCR-DGGE、454 焦磷酸测序、Illumina MiSeq以及宏基因组学等技术对微生物的种类、数量、分布以及动态变化进行研究。

早在1995年，唐玉明等［6］就采用纯培养方法从泸州老窖大曲分离到酵母菌、霉菌、细菌以及芽孢杆菌。而后，祝云飞等［7］人采用Biolog 技术来鉴定基于纯培养得到休哈塔假丝酵母。目前使用较多的方式，是将传统纯培养和顶空固相微萃取气质联用（HS-SPME-GC-MS）等新技术相结合研究大曲微生物，在一定程度上追溯浓香型大曲酒感官风味的来源。明红梅等［8］采用纯培养方法从浓香型大曲筛选出地衣芽孢杆菌和异常威克汉姆酵母等产浓郁香气的菌株。经HS-SPME-GC-MS 检测，两株菌产生的香味物质，如2,3,5-三甲基吡嗪等，皆是浓香型大曲香味的重要组成成分。大曲中的香味物质主要来源于细菌和酵母菌，对这些风味产生菌进行研究，能做到感官风味的溯源以及产香菌株的性能优化。由于白酒是地域性很强的产品，溯源其风味物质不仅有利于提高大曲质量，还有利于在异地重现名优酒品质和风味。

纯培养分离方法具有耗时长、效率低，且只能分离筛选一部分可培养微生物等缺点，于是各种非培养方式被不断地用于浓香型大曲微生物的研究。如表1 所示，叶光斌等［9］与Yan 等［10］采用PCR-DGGE 技术分析了大曲生产过程中细菌和真菌群落的多样性；Huang 等［11］采用454 焦磷酸测序技术分析了浓香型大曲高温制曲阶段微生物的多样性和丰富度；Wang 等［12］采用Illumina MiSeq技术分析了浓香型大曲中的好氧菌、兼性好氧菌；Yang等［13］采用Illumina MiSeq技术分析了不同时期菌的优势菌群；Wang 等［14］采用高通量测序分析得到了大曲优势菌群的种类；翟磊等［15］采用宏基因组学测得不同来源的大曲微生物种群，并比较了其差异性。PCR-DGGE和现代高效测序技术应用于大曲，能更加高效、全面地解析浓香型大曲微生物的多样性、群落结构及代谢功能［16-17］，揭示大曲制备过程中微生物的消长规律，证实大曲中各菌群之间紧密而复杂的代谢关系。相较于纯培养方法只能分离纯化部分大曲可培养微生物的种类，采用非培养方法中的测序技术既能系统高效地了解浓香型大曲不同阶段微生物的多样性和丰富度，打破惯性认知；又能准确得知微生物的代谢途径和产物；还能发现许多未知菌种，极大地丰富了浓香型大曲微生物数据库。采用非培养方式研究浓香型大曲中微生物群落多样性的做法固然高效全面，但是也并非没有缺点，如大曲中的乳球菌、链球菌、产芽孢杆菌等能够通过传统微生物手段纯化分离，但是PCR-DGGE 无法检出［18］。所以，对浓香型大曲中微生物菌落的多样性进行研究，最好是采用两种或者两种以上的检测手段，以保证试验结果的系统性、全面性和可靠性。

表1 浓香型大曲菌系的研究

浓香型大曲菌系庞大而复杂，且菌系的种类和数量影响着酶系和化合物的产生，直接决定大曲酒的酒质。非培养微生物的研究利于全面了解大曲微生物的种类、分布及其发酵机理，具有重要的研究意义；可培养微生物的研究则有利于从大曲中筛选到许多可应用于白酒酿造或更多行业的优良菌系，具有很强的现实意义。所以，在利用测序技术得到的微生物信息研究大曲发酵机理的同时，将高性能的可培养微生物进行筛选、鉴定，乃至研究其应用性，是目前研究大曲微生物较为全面的一种方式。

2 大曲酶系

酶是由生物细胞产生的、具有高度催化活性的蛋白质，一切微生物的生命活动都离不开酶［19］。浓香型大曲中多种微生物混合发酵，产生大量酶系才能满足大曲酒的酿造需求，其主要酶系有：淀粉酶、蛋白酶、氧化还原酶、纤维素酶、单宁酶、木聚糖酶、果胶酶、裂解酶、异构酶等［20］。各种酶系在白酒酿造中起到举足轻重的作用：如淀粉酶能将原料中分子量较大的淀粉分解成小分子的糖为酒精发酵奠定物质基础；蛋白酶能水解蛋白质产生氨基酸，并为微生物生长繁殖提供所需的营养物质；纤维素酶能水解植物细胞壁、释放胞内淀粉，提高出酒率；脂肪酶分解脂肪为微生物提供能量，为大曲酒的香味组成提供前体物质等。

糖化力和液化力是评价大曲质量的重要指标。最初对大曲酶系的研究，主要是采用传统化学法检测其糖化力和液化力。由于白酒行业的快速发展，传统方法因耗时长、效率低、试验结果精确度差等原因，逐渐不能满足大曲质量检测需求，所以引进新的检测技术就成了必然的选择，见表2。张强等［21］先用直接滴定法和比色法测定不同品牌大曲酶提取液的糖化力和液化力，再用高效液相色谱法（HPLC）对提取液中酶的反应产物进行分析，并计算其酶活力。研究表明，两次检测结果一致，证实了HPLC适用于分析大曲糖化力与液化力。

表2 浓香型大曲酶系的研究

对筛选到的特定功能菌所产粗酶的研究主要体现在利用纯培养的方法自大曲中分离筛选能分泌α-淀粉酶、蛋白酶、酯化酶等不同功能酶的菌株，分析其酶学性质。卫春会等［22］从浓香型大曲中分离到一株产蛋白酶活性较高的菌株，分析了其酶学性质以了解该酶的最适反应条件包括pH、温度、金属离子对该酶的影响机理。王玉霞等［24］测定了整个大曲制作过程中α-淀粉酶、单宁酶、木聚糖酶和脂肪酶酶活变化，以及产酶菌种的多样性，分析大曲曲皮、曲心的酶活变化。对特定功能酶进行分析，有利于后期进行分离纯化以及条件优化，提高功能酶的产量。而对不同时期的功能酶酶活变化进行研究，不仅有助于筛选特定功能酶产生菌，还能研究其酶学性质，为制备强化大曲和纯酶制剂打下基础。

近年来，主要通过组学技术全面研究大曲功能酶的数量、种类以及相应的作用机理。Huang 等［28］首次分析了浓香型大曲宏转录组，全面阐述了大曲活跃微生物的结构组成和代谢特点，证实耐热真菌是主要活跃微生物；其次挖掘了有关糖酵解、淀粉水解、丙酮酸代谢和乙醇代谢等代谢通路的关键酶；最后还证实了柠檬酸循环所产生的代谢产物是形成大曲风味的关键。Wang等［14］采用宏蛋白组学技术对浓香型大曲进行研究，确定了乳杆菌、曲霉、毕赤酵母、酿酒酵母和根霉是宏蛋白的主要来源。组学技术应用于浓香型大曲微生物代谢功能的研究，有利于后期白酒质量的优化以及更多有价值酶的挖掘。但是由于大曲样本多糖含量高和发酵产物复杂等原因，样品RNA 和蛋白的提取十分不稳定，极大地限制了组学技术在大曲方面的应用。

以上例子是大曲粗酶和组学方面的分析，展示了大曲酶的丰富种类与笼统的酶学功能，均未能清晰深入揭示大曲特有功能酶的酶学价值。目前来说，关于大曲特有功能酶系较为热点的研究是将来源于大曲的酶基因连接到不同的表达体系上，通过异源表达得到特定的纯酶，进而精确分析大曲特有酶的酶学特性。Yi 等［29］和Barkat 等［30］分别将基于宏转录组学得到的浓香型大曲中耐高温α-淀粉酶基因和β-葡聚糖酶基因，在毕赤酵母X33 和大肠杆菌中进行异源表达，得到了耐高温且热稳定性更好的α-淀粉酶纯酶和β-葡聚糖酶纯酶。基于宏转录组学的结果，可以从浓香型大曲中获得更多无法通过纯培养方法获取的不同功能的酶基因，并通过异源表达得到纯酶，研究它们在酿造过程中可能起到的协同作用。

长期以来，大曲酶系的研究都集中于大曲粗酶液和大曲来源微生物发酵粗酶液这两个方面，这些领域的研究有助于识别大曲中的主要酶系。首先大曲存在“一菌产多酶”、“一酶来自于多菌”的现象，对大曲粗酶液进行研究，利于功能酶产生菌的溯源及筛选。其次大曲中还有多种酶系来源于不可培养的微生物，利用现代组学技术获得其酶基因，通过异源表达得到纯酶，是大曲研究过程中取得的重大进步。然而无论是通过筛选功能酶产生菌获得的粗酶，还是通过异源表达获得的纯酶，若能研究、改进其酶学性质，通过单酶或复配手段真正应用于白酒生产，进一步提高白酒出酒率和酒质，对于白酒行业来说，都具有积极意义。

3 菌系、酶系在浓香型大曲中的应用

3.1 菌系

强化大曲是指通过人工接种纯种菌（如酵母菌、霉菌、酯化菌），在生产中能起到减少大曲的用量、提高淀粉利用率、粮食出酒率以及成品酒酒质的效果。自1982年起，田以清等［31］就制备出糖化力、发酵力都较高的强化大曲投用于生产。近年，杨跃寰等［32］从泸州老窖大曲中分离纯化得到棒曲霉和黑曲霉两株高产菌株并应用于大曲生产，发现大曲糖化力较稳定，且能在不影响大曲风味的情况下增加曲香（见表3）。总的来讲，适用于制备强化大曲的菌种都有长处和短板，例如：生香活性干酵母的发酵力很低，但能有效提高白酒中总酯和乙酸乙酯的含量；产酒精酵母的发酵力强，但酯化力通常很差。所以各菌种通常要进行复配使用，才能达到提高出酒率和感官风味的作用。陈雪玲等［33］研究发现，合适的复合菌剂能够在不改变大曲酸度的情况下，提高大曲糖化力、液化力、发酵力以及转化己酸乙酯的能力，丰富白酒的感官风味。谢国排等［34］从金种子浓香型大曲中分离出6 株产蛋白嗜热细菌，皆能产生不同的芳香族化合物、酚类、酯类等物质，不同菌株复配制成的强化大曲功能各有不同。柯涛等［35］采用气质联用（GC-MS）的方式对从糟培中筛选出的产香细菌进行分析，并接种最佳比例的复合菌剂应用于生产，发现其感官风味和理化性质都优于原大曲，而且顶火期持续时间也更长，有望赋予浓香型大曲部分酱香味，改善浓香型白酒的香味成分组成。

除了制备强化大曲，还可以通过改进制曲工艺提高大曲的质量。夏屿等［36］采用实时定量基因扩增荧光检测系统（qPCR）和高通量测序技术，分析比较热风干燥与自然干燥两种不同的处理方式下大曲真菌群落的变化差异。研究发现热风干燥有利于假丝酵母属生长，对排潮期大曲有积极意义，有助于改进传统制曲工艺，提高大曲质量。

大曲中的化合物不仅影响着菌系的物种多样性和丰富度，还起着投粮、丰富大曲酒感官风味的作用。化合物比例失调会在很大程度上影响大曲酒的感官风味，而在实际生产中通过调整菌种的丰富度，可以达到提高或降低大曲中某些化合物含量的目的，如通过酵母菌和乳酸菌的拮抗作用降低乳酸乙酯的含量。生产乳酸乙酯的前体物质是乳酸菌产生的乳酸以及酵母菌产生的乙醇，二者再通过酯化酶的作用生产乳酸乙酯。乳酸乙酯作为浓香型白酒重要的风味物质，它的比例是否恰当在很大程度上影响着原酒乃至成品酒的感官风味和质量［37］。浓香型白酒长期以来都存在着乳酸乙酯含量过高的情况［38］，“増己降酸”一度是众多酒厂关心的问题。罗青春等［39］从糟培中分离得到优势酵母菌和乳酸菌株，两株菌分别抑制对方生长，又相互作用生成乳酸乙酯。因此，在大曲培菌期适当引导酵母生长、减缓乳酸菌增殖，有助于降低乳酸乙酯含量。宋克伟等［40］从大曲中分离筛选到1 株枯草芽孢杆菌，通过试验可知该菌株能高效降解白酒中乳酸乙酯的含量，降解率高达20%。杨望军等［41］自大曲和酒醅中分离筛选到降解乳酸能力较强的解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌各1 株。模拟发酵结果发现解淀粉芽孢杆菌降解乳酸能力为25.97%，枯草芽孢杆菌降解乳酸能力为38.54%。

3.2 酶系

酶系在大曲中的应用不多，主要包括固定化酶和纯酶制剂的应用。固定化酶的应用在酿酒过程中较常见的是将糖化酶和液化酶固定在载体上，直接通过复配应用于生料酿酒，可以跳过酿酒原料蒸煮糊化的过程［42］。纯酶制剂在酿酒过程中的作用主要体现在降解原料中的纤维素，提高糖化力、出酒率以及酒质等方面。酿造白酒所用的原料都含有较多的纤维素，适量添加纤维素酶有利于破坏间质细胞壁的结构，释放淀粉。李旭晖等［43］将纤维素酶应用于大曲固态发酵过程（表3），试验结果表明：当纤维素酶添加量为0.005%（10 FPU/kg 酒糟），可将出酒率提高1 倍；当纤维素酶添加量为30 FPU/kg~50 FPU/kg（糟），所产白酒感官风味更突出，酒质更好。杂醇油是白酒主要香味成分之一，但含量过高会影响白酒的澄清度、降低酒质。孙金旭等［44］将酵母、糖化酶、蛋白酶、大曲等按比例复配，试验结果显示当蛋白酶含量适当时，可以明显抑制杂醇油的生成量。纯酶制剂也常通过复配再应用于大曲。阿米诺酶是白酒酿造中常用的复合酶制剂，包含根霉、曲霉、毛霉等多种性能优良的菌株产生的复合粗酶［45］。阿米诺酶作为一种工业酶制剂，不仅能糖化和发酵淀粉质原料，还具有耐高温和耐酸的性能。将阿米诺酶应用于浓香型大曲酒的生产以及双轮底工艺，不但能减少用曲量、提高出酒率，还能促进生香和提高酒质。

表3 菌系、酶系在浓香型大曲中的应用

4 结束语

浓香型大曲中菌系、酶系的数量和种类，决定着白酒的出酒率、酒质及风味。对大曲菌系、酶系进行研究，有利于更深层次地揭示大曲的发酵机理，还能在一定程度上推动白酒酿造行业的发展。之前由于技术限制以及认知不完全，只能简单筛选某些可培养微生物，粗略研究其酶学性质及代谢产物，并不能完全、深刻地阐明大曲的发酵机理。而如今，将新一代测序技术和组学技术（包括风味组学、基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学）相结合，研究大曲菌系、酶系的变化以及它们的关联性，有利于分析微生物群体的种类、进化和体外功能代谢，有利于全面了解大曲酶系的组成和调控机理。但由于大曲样本的复杂性，以及现有的科技瓶颈，只能得到可培养微生物和非培养微生物的群落多样性和部分群落功能。如果能将宏基因组、宏转录组与宏蛋白组结合，便能完善宏基因组和宏转录组的不足，在核酸分析的基础上对微生物表达蛋白进行分析，能够更好地解释浓香型大曲微生物的遗传和功能。在现代化的理论和科技支撑下，浓香型大曲微生物的群落结构、多样性以及代谢通路将会得到更清晰、更全面地阐述，新的功能酶将会被更多地挖掘并应用于大曲酒酿造，白酒固态发酵机理的解析必然会更加全面和透彻，并最终使得白酒固态发酵效率和品质进一步提升。