表面活性剂添加量对微生物电合成转化二氧化碳的影响

王光荣，宋天顺，谢婧婧

(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800)

随着人口的增长和经济的发展，减少传统的化石燃料燃烧产生的温室气体已成为迫在眉睫的问题[1-3]。目前，CO2作为一种潜在的碳资源，其转化固定的方法有很多，主要包括化学还原[4]、光催化[5]和生物还原等[6]。在现有技术中，微生物电合成系统 (MES) 是利用电活性微生物作为生物催化剂，在阴极表面获得电子，将CO2还原成有机化合物的一种新型微生物技术[7-8]。与生物光合作用和其他CO2固定方法相比，MES具有许多优势，如：电子受体来源广，转化效率高，成本低和反应条件温和[9-10]。

迄今为止，MES的操作效率主要受生物催化剂和电极材料的影响。MES系统中使用的生物催化剂可分为两大类：混合微生物菌群[10-11]和纯菌。其中，纯菌的生产力相对低于混合微生物菌群，但纯菌具有清晰的代谢途径，适合进行方法学的研究。主要的纯菌种类包括：Clostridiumljungdahlii[12]、Sporomusaovata[13-15]和Moorellathermoacetica[15]。更多对于MES的研究集中在对电极材料的修饰上，如在碳布和三维支架上装饰导电材料网状玻璃碳(RVC)[16]或泡沫镍[17]等，也可以利用析氢材料如碳化钼修饰电极[18]，增加电子的转移效率，从而提高乙酸盐的浓度。表面活性剂是一种两亲性的分子[19]，由于其会改变细胞表面的亲/疏水特性，提高细胞对营养底物的摄取和吸收[20]，帮助底物进入细胞[21]，增加底物利用率等[22-24]，多被用于提高发酵产物的产量[19]。但还未见添加表面活性剂对MES性能的影响，尤其是对C4产物的影响。通过前期的预实验，笔者发现非离子型表面活性剂聚乙二醇对C.ljungdahlii的毒性最小，故笔者主要研究不同添加量的聚乙二醇对MES性能的影响，以期对MES中如何提高电子传递速率提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料

C.ljungdahlii菌株是通过基因手段将丙酮丁醇梭菌的BAPP基因整合到Clostridiumljungdahii菌株的代谢通路中，由上海生命科学研究院植物生理生态研究所提供。

富集培养基(L)：胰蛋白胨10 g,酵母粉16 g,D-果糖10 g,NaCl 0.2 g,半胱氨酸0.3 g；微量元素2 mL,维生素1 mL，刃天青0.5 mL；用HCl调节pH为6.0。

阴极液培养基(L): 酵母粉1 g，NH4Cl 1 g, KCl 0.1 g, CaCl20.02 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, NaCl 0.8 g, KH2PO40.1 g, NaHCO31 g, Na2S 0.3 g,L-半胱氨酸盐酸盐0.3 g；微量元素10 mL,维生素1 mL,刃天青 0.5 mL；用HCL调节pH为 6.0。

阳极液培养基(L): NaCl 6 g, KCl 2 g；无机盐培养基(PETC培养基)50 mL，H2O 950 mL。

PETC培养基(L): NaCl 16 g,KCl 2 g,MgSO4·7H2O 4 g, NH4Cl 20 g, KH2PO42 g，CaCl20.4 g。

1.1.2 仪器

Keithley Instruments 2700数据采集器，美国吉时利电子有限公司；CHI 1000C、CHI 660E电化学工作站，CHI 1000C多通道恒电位仪，上海辰华仪器有限公司；H型MES反应器，广西理化有限公司；行稳阳极，中国宝鸡龙胜有色金属有限公司；GC-2010 Plus，SHIMADZU气相色谱仪，UV-1100紫外分光光度计，上海美谱达有限公司；DG 250厌氧工作站，广州华粤行仪器有限公司；Nafion 117质子交换膜，美国杜邦公司；辅酶II NADP(H)测试盒，苏州科铭生物公司；JSM-5900扫描电子显微镜，日本电子株式会社。

1.2 MES反应器的构建

采用双室H型反应器，结构见图1。由图1可知：用质子交换膜将阴、阳两室隔开，两室溶液体积均为250 mL。阴极电极材料为石墨毡，大小为5 cm×5 cm×0.5 cm，行稳阳极为具有铱和钌涂层的钛网，其物理表面积为25 cm2，阴阳极通过导线连接至电化学工作站和数据采集器，除实验因素外，外接电阻均为10 Ω。纯度为100%的CO2不断地通入MES的阴极室。使用多通道恒电位仪将阴极电位设置为-1.05 V。

图1 微生物电合成工作原理

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的液体活化

配置富集培养基，并于115 ℃灭菌30 min，冷却后放置在厌氧工作站中除氧，从-80 ℃冰箱取出C.ljungdahlii菌株，以10%的接种量活化，活化4～5次，当吸光度值(OD600)达到0.6时，向MES反应器的阴极室接入10 mL的菌液。

1.3.2 MES反应器的搭建与设置

本实验共搭建10组MES反应器，分别设为空白对照(CF)，以及添加0.5%、1.0%、2.0%和4.0%不同体积分数聚乙二醇(PEG)的实验组，每个实验组设置2组平行实验，每天取样1 mL，测定其OD600，然后将样品通过0.22 μm水系滤膜注入样品瓶中，在样品瓶中加入5 μL 体积分数为50%的HCL，混匀并测定其产物浓度。

1.4 分析方法

1.4.1 产物及H2浓度的测定与计算

在实验前后，用配备有热导检测器的气相色谱仪测量H2浓度。在正常工作的MES反应器内进行H2含量的测定。色谱柱为Porapak Q填充柱。具体检测方法：气化室温度为120 ℃；检测器温度为100 ℃；色谱柱温度为60 ℃，保留时间为5 min，无升温程序。测量前使用N2(纯度为99.999%)连续吹扫30 min使系统脱氧。

使用配备有氢离子火焰检测器的气相色谱仪分析MES反应器溶液中的产物。色谱柱型号：Agilent HP-INNOWax毛细管柱(30 m × 0.25 mm×0.25 μm)。气化室温度180 ℃，检测器温度为270 ℃。色谱柱升温程序：起始柱温为60 ℃，保留0.5 min；按每分钟10 ℃升温至200 ℃，保留0.5 min；共计15 min。载气为N2(纯度为99.999%)，流速为1.32 mL/min。

1.4.2 线性伏安曲线(LSV)的测量

在室温下，在标准三电极电化学池中进行线性扫描伏安法的测量。所有测试均在上述阴极液培养基介质中以阴极作为工作电极，行稳阳极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极。

1.4.3 还原当量的测定

使用辅酶Ⅱ NADP(H)测试盒对每组实验样品进行还原当量的测定(按照操作说明书进行)。

1.4.4 生物膜的电镜表征(SEM)

阴极表面的表面形态，根据参考文献[25]的方法固定化后，利用电子显微镜进行观察。

2 结果与讨论

2.1 PEG 对于MES 电化学性能的影响

在实验结束后，笔者对各实验组的电流和库伦效率(CEs)进行了分析，结果见图2。由图2可知：接种后立即产生电流，并在1.5 d左右变得相对稳定。1.0% PEG的电流最高，为10 mA左右；其次是0.5% PEG，其电流约为8.5 mA；再次是2.0% PEG，前5天电流均为8.0 mA左右，然后开始缓慢下降，可能是生物膜的增厚和底物浓度的增加导致反应速度降低[26-28]，到第7天，2.0%PEG的电流为6 mA，和CF的电流相似；4% PEG的电流最低。同时，实验结束后，通过计算产物库伦效率。由图2(b)可知：1.0% PEG，2.0% PEG和0.5% PEG的库伦效率较为相似，约为(42±1)%，然后是CF 39.5%，4.0% PEG 的库伦效率最低为34.3%。且4.0% PEG组的电流和库伦效率均低于CF，而其余实验组均高于CF，可能是4.0% PEG抑制了细胞生长，从而降低了电子的传递速率。

图2 添加不同体积分数PEG的电化学性能：电流量和库伦效率

2.2 PEG对MES产物的影响

实验过程中，每天监测反应器溶液中的OD600和产物浓度，结果见图3和表1。由图3(a)可知：接种后，阴极培养基的OD600在某种程度上代表了培养基中微生物的生长。由图3(a)可知：所有MES的初始OD600约为0.005，并且随着时间的延长迅速增加。在实验结束时，发现1% PEG 的OD600最高，为0.076，其次是0.5% PEG的OD600为0.070和2.0% PEG的OD600为0.066，均高于CF的OD600为0.060，而4.0% PEG的OD600要低于CF，仅为0.054。通过图3(b)、(c)和(d)观察到的MES反应器中的产物主要是乙酸盐，丁酸盐和少量乙醇。其中，1.0% PEG的最高乙酸产率为(0.73±0.11) g/L，其次是0.5% PEG，为(0.52±0.01) g/L，2.0% PEG为(0.51±0.01) g/L和CF(0.47±0.02) g/L，最低的是4.0%PEG，为(0.38±0.02) g/L。由表1可知：1.0% PEG中的乙酸盐产率为每天0.105 g/L，是CF组的 1.57倍，其次是0.5% PEG，为每天0.075 g/L和2.0% PEG，为每天0.073 g/L，分别是CF的1.12和1.09倍，4.0% PEG的乙酸产率最低为0.054 g/L，是CF的0.81倍。此外，随着时间的延长也产生了乙醇,乙醇有先增加后减少的趋势，但产物的浓度差异不大。

图3 添加不同体积分数PEG的MES实验：OD600以及乙酸、乙醇和丁酸产率

表1 添加不同体积分数PEG的OD600最大值和产物速率

在实验过程中还检测出丁酸作为C4产物且持续积累，结果见图3(d)。由图3(d)可知：1.0%PEG的MES的丁酸质量浓度最高，为(0.18± 0.01) g/L，其次是2.0%PEG,为(0.17± 0.01) g/L和0.5%PEG，为(0.16± 0.01) g/L，均要高于CF组的丁酸质量浓度(0.14± 0.01) g/L，而4%PEG的丁酸质量浓度最低，仅为(0.11± 0.01) g/L。相应的，1.0%PEG最高的丁酸产率为每天0.024 g/L，是CF的1.2倍。最后发现4.0%的PEG的产物(乙酸和丁酸)均要低于CF，可能是4.0%的添加量过高，对菌株的生长有较强的抑制作用[19]。这主要是由于C.ljungdahlii中丁酸途径的导入，可以利用来自阴极的H2作为MES中良好的电子载体，产生长链的C4产物。

2.3 生物膜分析

不同体积分数PEG的SEM图见图4。由图4可知：在阴极培养基中加入PEG有利于促进微生物的附着。图4中碳毡表面附着堆积的杆形或梭形菌株为本实验中的C.ljungdahlii菌株在实验过程中形成的生物膜，从碳毡表面菌株的附着情况可以侧面表示在MES反应器中菌株的生长情况。其中图4(c)中1.0%的PEG的实验组材料上附着的微生物最多；其次是图4(b)中0.5%的PEG实验组和图4(d)中2.0%的PEG实验组，图4(e)中4.0%的PEG实验组和图4(a)中CF的附着的微生物相差不大，在碳纤维中观察到较少的细菌。综上，由图4可以看出：低浓度PEG有利于微生物的附着，而高浓度的PEG浓度同样也不利于微生物的附着，这也和笔者的产物数据符合。

图4 CF，0.5% PEG，1.0% PEG，2.0% PEG和4.0% PEG的SEM

2.4 PEG影响MES性能的机制分析

实验结束后，除了分析其产物数据和生物膜，笔者也对其他的参数进行了分析，主要分析了线性伏安曲线、H2浓度和还原当量。

线性伏安曲线(图5)可以反映不同体积分数PEG对催化活性的影响。由图5可知：在-1.05 V时，0.5% PEG、1.0% PEG、2.0% PEG和4.0% PEG的阴极电流密度分别增加到-0.52、-0.86、-0.54和-0.36 mA/m2，具有1.0% PEG的MES的阴极电流密度比CF(-0.42 mA/m2)高2.1倍。阴极电流密度的增加表明：通过向阴极室中添加低浓度的PEG可以提高阴极的电子转移能力，加快CO2的还原速度。而4.0%的PEG的电流和电流密度均要低于CF，可能是添加高浓度PEG有一定的细胞毒性，从而抑制了菌株生长。

图5 实验结束后不同体积分数的PEG的线性伏安曲线

同时，笔者在实验开始前和结束后(图6)均测量了实验组的H2浓度。从图6(a)可以看出：在不使用C.ljungdahlii的情况下，H2产率随着PEG添加量的增加而增加，均远高于CF组。4.0% PEG具有最高的H2产量(1.56%)。由图6(b)可以看出：在C.ljungdahlii存在下，添加PEG的实验组在MES中产生的H2高于CF获得的H2，其中1.0% PEG 析出H2浓度最高，为0.121%，是CF(0.042%)的2.8倍；其次是0.5%PEG(0.085%)，2.0% PEG(0.073%)和4.0% PEG(0.058%)，分别是CF的2.02、1.74和1.38倍。

图6 实验前后不同体积分数PEG的H2浓度

由于PEG是一种非离子型表面活性剂，加入PEG可提高溶液中H2的产率，这和文献[29-30]报道的现象一致。而实验结束后各实验组的H2浓度均低于实验开始前，可能是因为MES系统中的微生物会持续消耗H2[31]，C.ljungdahlii可以利用来自阴极的H2作为MES中良好的电子载体。而2.0% PEG和4.0% PEG的产H2浓度并没有随着PEG添加量的增加而增加，可能是因为随着时间的延长，过高的表面活性剂浓度反而影响了其本身的表面活性[32-33]，从而影响了反应器中H2的产生。

实验结束后的还原当量见图7。由图7可知：低浓度PEG的还原当量较高，包括1.0%和0.5%的PEG，其次是2.0%的PEG，而4.0%的PEG和CF的还原当量相对较低。相应的，1.0% PEG的乙酸和丁酸累积达到的产量最高，分别为(0.73±0.11) g/L和(0.18±0.01) g/L，其中，MES丁酸产率是CF的1.21倍，乙酸产率是CF的1.58倍。在其他添加PEG的MES中观察到了相同的趋势。随着H2浓度的提高，丁酸与乙酸的增加率之差变大。这种现象表明在MES系统中H2含量即还原力在产物调节中起着重要作用。

图7 不同体积分数PEG的还原当量

由以上结果可以说明：加入低浓度的PEG有助于H2的产生，从而提高代谢通路中的还原力及电子传递效率。在-1.05 V电势下会发生H2析出，从而提高电子传输速率和MES的性能。在笔者的研究中获得的产品不仅限于乙酸、丁酸产率，产量每天为0.024 g/L，这主要与引入丁酸代谢途径有关。在C.ljungdahlii的代谢途径表明(图8)，C.ljungdahlii包括Wood-Ljungdahl途径，可通过该途径将CO2还原为乙酰-CoA，而乙酰-CoA可进一步转化为乙酸和乙醇[34]。在此过程中，乙醇的产生是可逆的，这解释了为什么乙醇的产生如此之低，并且在MES系统中未观察到乙醇的积累。通过将丁酸盐生产途径引入C.ljungdahlii，还可以将乙酰-CoA转化为丁酸。乙酸和丁酸均由乙酰-CoA转化而来，因此，乙酸和丁酸的产量同时增加。丁酸生产需要C.ljungdahlii代谢途径中的高浓度质子。质子来自两种不同的途径。质子可能来源于阳极中的水电解，通过H+依赖的ATPase酶转运蛋白进入细胞膜，促使细胞生长并伴随ATP的合成[35]。质子也可以由H2生成，通过被动扩散进入细胞膜，经过双功能电子传输氢化酶转化为质子[36-37]。而PEG的存在可以改善H2的产生，从而为丁酸盐的生产提供更多的质子，提高还原当量。

图8 C. ljungdahlii的代谢路径[34]

3 结论

研究了非离子表面活性剂PEG的添加量对MES性能的影响，结果发现体积分数为1.0%的PEG的MES性能最好，其乙酸和丁酸质量浓度能分别达到(0.73±0.117) g/L和(0.18±0.01) g/L，是CF的1.58和1.21倍。其机制可能是由于低浓度的PEG的细胞毒性相对较低，同时可以增加H2产生，从而提高了电子的传递效率，增加产品浓度。而4.0%PEG的丁酸盐浓度仅为(0.11± 0.01) g/L，要低于CF，可能是4%的添加量过高，抑制了菌株的生长。