基于多指标成分含量测定的肺宁合剂与中药配方颗粒比较

沈 申,严宝飞,陈亚运,戴仕林,刘圣金,朱星宇,刘 嘉,富莹雪

(1.南京中医药大学附属医院 制剂部,江苏 南京 210009;2.南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210023;3.江苏卫生健康职业学院 药学院,江苏 南京 211800)

肺宁合剂是江苏省中医院的特色医院制剂,由麻黄、苦杏仁、甘草、前胡、桔梗、瓜蒌皮及枇杷叶合用,具有疏风达邪、宣肺化痰和降逆止咳之功效。全方宣中有降、散中寓清,俾宣降有致及温润有度,颇合肺脏之性；并且不偏寒热,适应证较广,主要用于急性支气管炎、上呼吸道感染、慢性支气管炎急性发作及感冒后咳嗽等[1-2]。自20世纪70年代投入使用以来,经临床数以万计的病例验证,其治疗效果满意,每年可为数十万病人解除病痛[3-5]。

中药配方颗粒是一种新型的中药饮片,主要由单味饮片经提取、浓缩、干燥及制粒加工而成,具有质量稳定、规范及携带方便和服用简单等诸多优点,在中医临床上正逐渐成为传统饮片的药剂补充。但是,配方颗粒的服用方法为直接开水冲服,与传统汤剂相比,缺少了组方药物“共煎”的过程。因此,其与传统饮片在化学成分、临床功效方面的一致性等方面亟待深入研究[6-9]。

广义的化学成分是中医方剂发挥其功效的物质基础[10],中药化学成分种类、含量与中药功效多样性联系紧密,本研究选择肺宁合剂中的君药(麻黄、苦杏仁和甘草)以及臣药(前胡)中的麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7种与其临床功效密切相关的指标成分进行含量测定[11-14],从物质基础角度直观比较传统饮片与配方颗粒之间的异同。中药及其组方中化学成分可通过多种途径,作用于多个靶点,影响多个生物学功能及通路参与疾病的治疗[15],且中药及其组方中化学成分的“量”与“效”关系密切[16],故本研究采用网络药理学的方法探讨二者含量差异显著的指标成分的作用途径和通路,希望从分子机制水平阐述含量差异对肺宁合剂对相关疾病的治疗影响,以期对中药配方颗粒进一步研究与应用以及肺宁合剂质量标准的提升提供一定的思路和参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱系统,美国Waters公司;BT25S十万分之一电子天平,德国Sartorius公司;As3120型超声波清洗器,天津奥特赛恩斯仪器有限公司;Anke GL-16g2型离心机,上海安亭仪器厂;RE-201d型旋转蒸发系统,上海保玲仪器设备厂。

1.2 药材与试剂

1.2.1 药材

对照品麻黄碱(批号:171237-201208)、伪麻黄碱(批号:171241-201007)，苦杏仁苷(批号:110820-201607)，甘草苷(批号:131704-201605)，甘草酸(批号:110731-201317)，白花前胡甲素(批号:112112-201203)，白花前胡乙素(批号:111904-201203),中国食品药品检定研究院,含量均大于98%,化学结构式见图1。

图1 7种指标成分的化学结构式

炙麻黄饮片(批号:1706144)，安徽协和成药业饮片公司；甘草饮片(批号:1708142)、苦杏仁饮片(批号:1708146)、桔梗饮片(批号:1707136)、瓜蒌皮饮片(批号:1705089)、前胡饮片(批号:1706189)、炙枇杷叶饮片(批号:1701105)，安徽井泉中药饮片有限公司;炙麻黄颗粒(批号:1707142)、甘草颗粒(批号:1710138)、苦杏仁颗粒(批号:1708145)、桔梗颗粒(批号:1801002)、瓜蒌皮颗粒(批号:18010371)、前胡颗粒(批号:1710145)、炙枇杷叶颗粒(批号:1707003),自制。以上7种中药饮片均经南京中医药大学刘圣金教授鉴定,分别为草麻黄(EphedrasinicaStapf)的干燥草质茎,甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根和根茎,山杏(Prunusarmeniaca(L.)Lam.)的干燥成熟种子,桔梗(Platycodongrandiflorus(Jacq.))A.DC.的干燥根,栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的干燥成熟果皮,白花前胡(PeucedanumpraeruptorumDunn)的干燥根,枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.)的干燥叶。

1.2.2 试剂

乙腈(C2H3N),美国TEDIA公司；H3PO4,美国ACS公司;H2O为超纯水,苏州Milli-Q纯水机自制。

1.3 方法

1.3.1 肺宁合剂传统饮片汤剂的制备

将一定量的炙麻黄饮片、甘草饮片、苦杏仁饮片、桔梗饮片、瓜蒌皮饮片、前胡饮片和炙枇杷叶饮片置于密闭容器中,加入8倍量H2O,静置30 min后煎煮40 min,过滤,滤渣继续用6～8倍H2O煎煮40 min,合并滤液,浓缩至250 mL,即得。

1.3.2 中药配方颗粒汤剂的制备

精密称取相当于肺宁合剂传统饮片汤剂中各原药材的中药配方颗粒,适量混合后，加入一定量的沸水,搅拌溶解,冷却至室温,定容至250 mL,即得。

1.3.3 供试品溶液的制备

精密吸取肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂各4 mL至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,超声30 min,冷却,补足甲醇至刻度,摇匀,离心10 min(取上清,13 000 r/min)后,过0.45 μm微孔滤膜,即得供试品溶液。

1.3.4 对照品溶液的制备

分别精密称取麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素对照品适量,加甲醇制成分别含上述对照品446.5、365.1、1 231.8、550.2、682.2、53.5和43.2 μg/mL的混合对照品溶液,分别稀释2、4、8、16和32倍备用。

1.3.5 色谱条件

色谱柱为Thermo-C18endcapped(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.1%(体积分数，下同)H3PO4-H2O-C2H3N(B),梯度洗脱(0～10 min,5%B;10～30 min,5% ～10%B;30～50 min,10% ～15%B;50～70 min,15% ～22%B;70～75 min,22% ～30%B;75～95 min,30%～60%B;95～105 min,60% ～80%B;105～115 min,80% ～95%B;115～120 min,95%～5%B),柱温为30 ℃,检测波长为210 nm,流速为0.8 mL/min,进样量为10 μL。

1.3.6 线性关系的考察

准确移取1.3.4节中7种对照品制成的混合对照品溶液,按照1.3.5节中的色谱条件进样,记录7种指标成分色谱峰的峰面积。以标准品浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),得出线性关系。依据信噪比计算检测限(LOD)、定量限(LOQ)。

1.3.7 精密度试验

准确移取1.3.4节中7种对照品制成的混合对照品溶液,按照1.3.5节中的色谱条件进样，1 d内连续进样6次，在连续3 d内重复进样6次,记录7种指标成分色谱峰的峰面积,计算7种指标成分的相对标准偏差(RSD)。

1.3.8 稳定性试验

准确量取肺宁合剂传统饮片汤剂样品6份,按照1.3.3节中的方法，制备供试品溶液,按照1.3.5节中的色谱条件，在0、3、6、9、12和24 h进样,记录7种指标成分色谱峰的峰面积,计算7种指标成分的RSD。

1.3.9 重复性试验

准确量取肺宁合剂传统饮片汤剂样品6份,按照1.3.3节中的方法制备供试品溶液,按照1.3.5节中的色谱条件连续进样,记录7种指标成分色谱峰的峰面积,计算7种指标成分峰面积的RSD。

1.3.10 回收率试验

采用加样回收法(按体积比1∶1加入,下同),精密量取肺宁合剂传统饮片汤剂2 mL,至10 mL量瓶中,精密加入各对照品适量,按照1.3.3节中的方法制备供试品溶液,平行制备6份。按照1.3.5节中的色谱条件连续进样,计算7种成分的平均回收率和RSD。

1.3.11 样品指标成分含量的测定

准确量取1.3.3节中制备的肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂供试品溶液,按照1.3.5节中的色谱条件进样,每份样品进样3次，取平均值，记录麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7种指标成分的含量。

1.3.12 差异成分作用靶点的获取

利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以1.3.11节中得出的差异成分为关键词检索作用靶点。登录蛋白质数据库UniProt(http://www.uniprot.org/),设置物种为“人”的UniProt KB数据,利用perl语言工具(http://www.perl.org/)校正预测的靶点名称。

1.3.13 差异成分作用靶点的生物功能注释及通路分析

将1.3.11节获取的作用靶点的编码基因导入Bioconductor生物信息软件包(http://www.bioconductor.org/),以P<0.05进行基因本体论(GO)功能注释及基因的基因组百科会书(KEGG)通路富集分析,得到差异成分作用靶点的主要生物功能和过程及其发挥中医临床功效可能性较大的通路。

2 结果与讨论

为尽可能全面地反映肺宁合剂传统饮片汤剂与中药配方颗粒汤剂中的化学成分信息,本研究对流动相系统中H3PO4-C2H3N、甲酸水-C2H3N、H3PO4-甲醇和甲酸水-甲醇进行了比较,结果以H3PO4-C2H3N为流动相系统干扰小、色谱峰分离效果较好。本研究亦对H3PO4-H2O的体积比(0.05%、0.1%和0.2%)进行考察,结果表明：体积分数0.1%H3PO4-H2O能较好地改善峰形。因此,本研究确定以体积分数0.1%H3PO4-H2O-C2H3N为流动相系统。对洗脱程序进行了考察,发现7种指标成分可分为生物碱类、苷类、黄酮类、三萜类和香豆素类5类化合物,结构和类型差异明显,本研究确定的梯度洗脱程序色谱信息丰富且指标成分均达到基线分离。对样品进行紫外-可见波长(190～400 nm)扫描。结果显示：麻黄碱、伪麻黄碱仅在210 nm有紫外吸收,此时苦杏仁苷亦有最大紫外吸收,甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素紫外吸收也较强。因此,本研究确定的检测波长为210 nm。对柱温(20、25、30和35 ℃)进行比较,结果显示：当柱温升高时,色谱峰的保留时间会发生前移,当柱温达到35 ℃时,基线不能完全分离。因此,综合考虑保留时间及分离度等因素,本研究确定以30 ℃为柱温。

2.1 高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)分析结果

混合对照品溶液、肺宁合剂传统饮片汤剂、中药配方颗粒汤剂的高效液相色谱图见图2。由图2可知：麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7种指标成分的保留时间分别为16.2、18.3、33.6、57.9、87.1、103.7和109.4 min;肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂在相同保留时间基本均有共有峰,但共有峰峰面积存在差异,即肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂在化学组成上差异不大,但含量上存在差异。

图2 混合对照品、肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂的HPLC-UV色谱

2.2 线性关系的考察结果

麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7种指标成分线性关系考察结果见表1。由表1可知：7种指标成分在各自线性范围内线性关系良好,可用于准确定量。

表1 7种指标成分的线性关系

2.3 方法学的考察结果

麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7种指标成分的精密度、稳定性、重复性和加样回收率结果见表2。由表2可知：本研究建立的方法具有良好的精密度、稳定性、重复性和加样回收率。

表2 7种成分精密度、稳定性、重复性及加样回收率试验结果(n=6)

2.4 样品指标成分含量的测定结果

肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂中麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素成分含量见表3。由表3可知：肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂中均含有麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素，但含量存在差异。肺宁合剂传统饮片汤剂中的麻黄碱、伪麻黄碱和甘草苷含量显著性大于中药配方颗粒汤剂,而苦杏仁苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量在两者间无显著性差异。

表3 肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂中7种成分含量的测定结果(n=3)

2.5 差异成分作用靶点的获取结果

肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂中的差异成分麻黄碱、伪麻黄碱和甘草苷在TCMSP数据库对应的作用靶点为24个,结果见表4。由表4可知：差异成分麻黄碱、伪麻黄碱和甘草苷可能通过多种作用靶点造成肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂的临床疗效的差异。

表4 差异成分作用靶点

2.6 差异成分作用靶点的生物功能注释及通路分析

本研究借助R语言,运用“clusterProfiler”程序包,利用Bioconductor提供的GO注释信息和KEGG通路数据库获取富集分析结果。由GO功能分析获得63个条目,其中具有显著意义的有48个条目(P<0.01),采用P值和基因富集数量综合过滤,对其进行排序,取排名前20的条目,结果见图3。由图3可知:差异成分作用靶点富集显著的生物学功能主要为G蛋白偶联胺受体活性、肾上腺素能受体活性、儿茶酚胺结合,提示差异成分麻黄碱、伪麻黄碱和甘草苷可能通过多种生物学途径造成肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂的临床疗效差异。

图3 差异成分作用靶点GO功能分析结果

KEGG通路富集分析共获得9条通路,具有显著意义的有2条通路(P<0.01),采用P值和基因富集数量综合过滤,对其进行排序,结果见表5。由表5可知:差异成分作用靶点基因显著富集在信号通路为cGMP-PKG信号通路、钙信号通路,提示差异成分麻黄碱、伪麻黄碱和甘草苷可能通过cGMP-PKG信号通路、钙信号通路引起肺宁合剂传统饮片汤剂和中药配方颗粒汤剂的临床疗效差异。

表5 差异成分作用靶点KEGG通路富集分析结果

3 结论

采用的中药配方颗粒的生产原料来源与实验中采用的饮片药材一致,可以消除不同批次、不同产地药材之间的品质差异带来的影响,保证实验结果的科学性。

本研究建立的HPLC-UV法精密度高、重复性好,系统分析了江苏省中医院特色制剂肺宁合剂传统饮片汤剂与中药配方颗粒汤剂化学成分的相似性,首次同时对其中与肺宁合剂临床功效密切相关的麻黄碱、伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸、白花前胡甲素和白花前胡乙素7种指标成分进行定量分析,从功效物质基础角度全面评价二者之间的异同,发现二者化学组成上差异不大,但含量存在差异,其中肺宁合剂传统饮片汤剂中的麻黄碱、伪麻黄碱和甘草苷含量显著性大于配方颗粒汤剂,3个差异成分可通过干预24个靶点、9条通路引起肺宁合剂传统饮片汤剂和配方颗粒汤剂临床疗效的差异。说明用中药配方颗粒代替传统饮片生产的肺宁合剂的可行性还需要被进一步论证,提示未来将在中药配方颗粒的提取工艺和质量标准上进行进一步的提升以及在传统复方汤剂的化学成分、临床功效方面的一致性上还需继续进行深入的研究。