桃叶珊瑚苷药理作用及分子机制研究进展

2021-11-05朱志铭任朝兴

生物加工过程 2021年5期

朱志铭，任朝兴，马博

(南京工业大学药学院，江苏南京 211800)

桃叶珊瑚苷(aucubin, AU)，又称为珊瑚木苷，是一种天然的环烯萜苷化合物，其结构式见图1。1905年，AU被首次发现于东瀛珊瑚(AucubachinensisBenth.)的叶中[1]，是玄参(ScrophularianingpoensisHemsl)、杜仲(EucommiaulmoidesOliver)和车前草(PlantagodepressaWild)等中草药的有效成分之一。AU具有广泛的药理活性，可以抑制氧化应激反应(oxidative stress)、内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress)，降低炎症(inflammation)等，起到抑制神经、生殖、心血管、骨和眼损伤的作用[1]。笔者综述了AU的药理作用及其分子机制，以期为AU的研究和开发应用提供相关参考。

图1 AU结构示意

1 桃叶珊瑚苷的分子机制

AU是一种高活性物质，对核因子E2 相关因子2(Nrf2)、核因子-κB(NF-κB)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、NO、C-Jun 氨基末端激酶(JNK)等多条信号通路均有调节作用。

1.1 激活Nrf2信号通路

Nrf2是一种参与细胞内氧化微环境调控的重要转录因子，正常生理状态下，环氧氯丙烷(ECH)相关蛋白 1(Keap1)可以与Nrf2结合，进一步通过泛素化或蛋白酶途径将其降解。在氧化应激状态下，Keap1 中的高反应性半胱氨酸残基被氧化，Keap1 无法与Nrf2 结合以进行泛素化。随后，Nrf2 积累并转移到细胞核中，与抗氧化反应元件(ARE)结合，启动下游超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的翻译和转录，修复氧化损伤，在治疗男性不育、骨关节炎(OA)、糖尿病(DM)等疾病中发挥着重要作用[2]。

AU可以诱导Keap1构象改变，使Keap1和Nrf2分离，阻止Nrf2的降解，促进Nrf2核易位，上调SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的蛋白表达，促进内源性抗氧化防御[3- 4]，治疗胃黏膜损伤、内皮功能障碍、骨关节炎和糖尿病等疾病[4-8]，AU对Nrf2的调节过程见图2。

图2 AU对Nrf2的调节示意

1.2 激活AMPK信号通路

AMPK是一种杂合三聚体，含有α催化亚基以及β、γ调节亚基，是调节细胞能量、自噬和氧化应激的关键蛋白，在治疗脂肪肝、高脂血症等疾病中发挥着重要作用[9-10]。

AU对AMPK的调节示意见图3。AU通过促进乙酰辅酶A(ACC)的磷酸化，激活蛋白激酶B(AKT)，促进AMPKα和AMPKβ的磷酸化，以激活PPARα、 PPARγ以及Nrf2，从而抑制脂肪的生成和促进脂肪酸的氧化，可用于治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)[10]。

图3 AU对AMPK的调节示意

1.3 激活NF-κB信号通路

NF-κB是一种与炎症激活密切相关的重要的核转录因子，在参与调节炎症反应、免疫调节和细胞增殖等过程中发挥着重要作用。NF-κB在稳定状态下，以一种异源三聚体复合物的形式存在于细胞质中，其中最广泛的结构是由2个亚基p65、p50和一个抑制性亚基IκB组成。在炎症、细胞因子等因素的刺激下，细胞膜上受体蛋白通过激活IκB激酶(IKKα)，随后IKKα将细胞内NF-κB·IκB复合物的IκB亚基调节位点的丝氨酸磷酸化，使得IκB亚基被泛素化修饰，进而被蛋白酶降解，从而释放NF-κB p65二聚体，游离的NF-κB p65会进入细胞核，启动下游白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子的翻译和转录，在动脉粥样硬化、骨关节炎和糖尿病等疾病的发展中起到重要作用[11-12]。

AU对NF-κB的调节示意见图4。AU可以抑制IKKα的活化，降低IκB的活性，进而阻止NF-κB p65的核转位，以下调下游基因的转录以及炎症因子的表达，抑制炎症反应[4, 13]，可用于治疗动脉粥样硬化、干眼病、骨关节炎以及糖尿病肾病(DN)等疾病[4, 6, 13-15]。

图4 AU对NF-κB的调节示意

1.4 调控NO

NO是一种不稳定具有反应性的自由基，由一氧化氮合酶(NOS)生成，NOS有3种亚型，分别为神经型一氧化氮合酶(nNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)[16]。

由nNOS产生的NO对心脏的心肌收缩和舒张具有调节作用[17]。在体内外实验中，AU均可诱导nNOS表达增加，提高NO水平，抑制心肌梗死(MI)引起的左心室重构(LVR)[18]。然而，在对骨关节炎的研究中发现，AU可以抑制iNOS的mRNA和蛋白表达，以抑制NO的形成，治疗骨关节炎[13]。

1.5 其他

JNK是一种应激活化蛋白激酶，易感受到细胞因子、紫外线和生长因子等胞外刺激，在调节细胞凋亡、增殖和炎症等细胞功能中起到重要作用，对治疗骨关节炎、男性不育具有重要意义[19-20]。

AU对JNK的调节示意见图5。AU可以抑制JNK的磷酸化，抑制BAX的蛋白表达，促进Bcl-2的蛋白表达，抑制半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶(Caspase-3)的剪切，以抑制细胞凋亡，保护生殖系统以及减缓骨关节炎进程[3, 21]。

图5 AU对JNK的调节示意

炎症小体(inflammasome)活化是由多蛋白复合物组装信号介导的炎症相关的Caspase活化以及IL-1β等炎症因子的成熟过程。其中常见的NACHT、LRR 和PYD 结构域包含蛋白3(NLRP3)炎症小体由NLRP3、ASC以及p-Caspase-1间的相互作用形成，其与心血管疾病的发展密切相关[22-23]。

AU对NLRP3炎症小体的调节见图6。AU通过抑制活性氧(ROS)以及硫氧还原蛋白相互作用蛋白(TXNIP)的形成，使NLRP3炎症小体失活，抑制炎症反应和细胞凋亡，改善心脏功能障碍[24]。

图6 AU对NLRP3炎症小体的调节示意

2 桃叶珊瑚苷的药理作用

AU有着十分广泛的药理活性，具有保护神经和生殖系统、降低血糖水平、抗骨关节炎、抗骨质疏松、抗肿瘤以及抗老化等作用。

2.1 对神经系统的保护作用

神经系统的疾病已经是导致人类死亡的第二大原因[25]。神经元细胞损伤导致的运动、认知和行为功能障碍是神经系统常见的病理特征。对神经元细胞损伤的修复可以起到治疗帕金森氏病(PD)、阿尔茨海默氏病(AD)和癫痫(EP)等神经系统疾病的作用[26]。

AU可促进分化神经元的细胞存活，增加神经丝蛋白(NF)-H、NF-M、突触后致密蛋白(PSD-95)、生长相关蛋白(GAP-43)以及神经元特异核蛋白(NeuN)的蛋白表达，促进分化神经元的细胞存活；同时，AU还可显著增加谷氨酸脱羧酶65/67(GAD 65/67)免疫反应的细胞数量并上调GAD 65/67的蛋白表达，以促进神经元细胞向GABA能神经元分化，修复神经元细胞损伤[27-28]。

帕金森病小鼠在给予AU治疗后，极下降测试和牵引测试中的运动性得到恢复，多巴胺能神经元损伤及炎症反应被抑制，且小鼠纹状体中的多巴胺和酪氨酸羟化酶水平提高[29]。并且，AU可以显著减轻大鼠癫痫持续状态(SE)，降低癫痫发作强度，延长发作的潜伏期。给药治疗1周后，癫痫大鼠DG、Hilus、CA1和CA3海马区的神经元细胞凋亡率降低[30]。深入研究后发现：AU通过抑制炎症反应和调节神经传递发挥抗癫痫作用，小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的活化减弱，IL-1β、HMGB1、TNF-α的蛋白表达降低。此外，AU还可以增加GABA、GABAARα1和GLT-1的蛋白表达，降低细胞内谷氨酸浓度[14]。

总之，AU具有显著的神经元细胞保护作用，可以抑制神经元细胞的凋亡，调节神经递质，治疗帕金森病、癫痫等疾病。此外，AU对其他一些神经病变也有一定的治疗作用。Xue等[31]研究发现：AU可以显著抑制H2O2诱导的PC12细胞(从大鼠嗜铬细胞瘤细胞获得)凋亡，降低细胞内丙二醛(MDA)水平，增强SOD、CAT和GSH-Px的活性，减轻细胞核氧化损伤，治疗神经退行性病变。紫杉醇是一种化学治疗剂，会引起周围神经的病变，这是其主要的剂量限制副作用。Andoh等[32]研究发现：AU可以抑制紫杉醇诱导的机械性异常性疼痛，以及脊髓背角神经元的自发性和机械性刺激引起的放电。进一步研究发现：AU通过降低内质网应激蛋白(CHOP)的蛋白表达，抑制外周雪旺细胞系(LY-PPB6 cells)内的内质网应激，以达到抑制周围神经机械性异常性疼痛。

2.2 对糖尿病及其并发症的治疗作用

糖尿病已成为21世纪的主要流行病，国际糖尿病联合会(IDF)曾预测到2017年，全世界共有4.51亿成年人患有糖尿病[33]。AU可以降低糖尿病大鼠血糖，抑制糖尿病大鼠肝脏和肾脏中脂质过氧化水平，提高抗氧化酶活性。并且，AU可以显著改善糖尿病大鼠胰腺功能，增加胰β细胞的数量[34]。

长期的糖尿病状态会导致晚期糖基化终产物(AGEs)水平升高，进而诱发多种严重的糖尿病并发症。Jung等[35]研究发现：AU可显著抑制AGEs的形成，在体内实验中，AU呈剂量依赖性抑制甲基乙二醛(MGO)诱导的AGEs-牛血清白蛋白及其与胶原蛋白交联物的形成，并且抑制了AGEs的形成以及在各组织(肾脏、血管、心脏和视网膜等)中的积累；在体外实验中，AU可清除MGO，具有抑制AGEs相关的各种慢性疾病的药理潜力。

Xue等[5, 36]研究发现：AU可以降低糖尿病大鼠的血糖水平，预防并发症并改善糖尿病大鼠的生活质量，减少糖尿病性脑病大鼠的Y迷宫测试的错误率，提高糖尿病大鼠认知能力。进一步研究还发现：AU通过提高抗氧化酶活性，抑制脂质氧化物的生成，以抑制大鼠海马CA1区神经元细胞的凋亡，发挥保护糖尿病大鼠神经功能的作用。此外，Kim等[37]研究发现：AU可以促进神经干细胞中神经元分化和神经突增生。并且，坐骨神经损伤给药治疗3周后，AU促进了轴突的延长，轴突的厚度和髓鞘增生。

Ma等[4]研究发现：AU可有效治疗糖尿病肾病，给药治疗10周后，AU可显著降低小鼠尿蛋白排泄率，抑制肾小球基底膜增厚和肾纤维化，减少氧化应激和炎症反应。进一步研究还发现：AU能够诱导SIRT1和SIRT3介导的Nrf2、FOXO3a的激活和核转位，促进抗氧化酶以及抗氧化剂的基因表达；并且可以抑制NF-κB p65的核转位，抑制炎症因子的表达，发挥保护肾脏组织的作用。

2.3 对心血管系统的保护作用

心血管疾病是严重威胁人类生命健康的疾病之一。心肌纤维化是各种心血管疾病的关键特征，会损害心脏的收缩和舒张功能。Xiao等[38]研究发现：AU可以抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖，并抑制成纤维细胞活化为肌成纤维细胞。此外，AU显著降低了肌成纤维细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ及FN等纤维化相关蛋白的表达。进一步研究发现：AU通过诱导AMPK的磷酸化和抑制mTOR活性，以抑制成纤维细胞的增殖和活化功能[38]。此外，Park[39]研究发现：AU可以显著抑制小鼠胚胎成纤维细胞(3T3-L1)中TNF-α的合成，抑制PAI-1、 MCP-1和IL-6在内的动脉粥样化脂肪因子的蛋白表达，改善肥胖症引起的动脉粥样硬化。

心肌梗死后会引起左心室重构，包括左心室大小、形态、功能和细胞分子的复杂变化[40]。AU可以显著抑制脂多糖(LPS)诱导的心脏内氧化应激和炎症反应，抑制细胞凋亡，改善小鼠心脏功能障碍[24]。Yang等[18]研究发现：AU可以有效提高心肌梗死小鼠的存活率，并减缓心肌梗死诱导的左心室重构过程，给药治疗2周后，氧化应激标志物明显降低，心脏梗死面积减少，心脏功能得到恢复。进一步研究发现：AU通过激活nNOS/NO信号通路，增加NO的含量，降低氧化应激反应，并且增加硫氧还原蛋白(Trx)含量，抑制ASK1/JNK信号通路，以减缓心肌梗死引起的左心室重构过程，增强小鼠的心功能和提高小鼠生存率[18]。此外，Wu等[8]还研究发现：AU可以通过诱导eNOS的表达，增加NO的含量，以达到通过激活β3-AR/adenylate cyclase/cAMP信号通路，降低心脏内氧化反应，抑制心肌肥大，减缓心脏重构，改善心功能。

AU还有促进血管生成的作用，可以抑制炎症因子的mRNA表达，以抑制LPS所致的人脐静脉血管内皮细胞系(HUVECs)损伤[41]。此外，Chen等[42]研究发现：AU可以促进小鼠后肢肌肉灌注速度，减少组织损伤，促进缺血后肢的血管生成。进一步研究发现：AU通过激活依赖于雌激素的VEGF/Akt/eNOS信号通路诱导血管生成，治疗周围血管疾病[41]。

2.4 抗骨质疏松和对骨关节炎的作用

骨质疏松症(OP)是一种代谢性疾病，其特征在于成骨细胞的分化和增殖减少以及破骨细胞的过度分化与增殖。AU可以显著上调人成骨细胞系(MG63)中CollagenⅠ、Integrinβ1、Osterix、OCN、OPN和BMP2等反映骨形成的标志性蛋白表达，促进成骨细胞的分化，增加皮质骨厚度、骨密度以及使小骨梁变紧密，具有潜在治疗骨质疏松症的作用[43-44]。Zhu等[45]研究发现：AU可以增加钛微粒处理过的小鼠成骨细胞系(MC3T3-E1)活性，减少氧化应激标志物的表达，降低氧化应激反应，抑制细胞的凋亡。进一步研究发现：AU通过激活BMP2/Smads/RunX2信号通路，增加碱性磷酸酶(ALP)的活性以及抗氧化酶和成骨因子的蛋白表达，降低氧化应激反应；以及通过提高Bcl-2蛋白的表达，抑制B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白(BAX)的表达，降低MC3T3-E1细胞的凋亡率，发挥促进成骨的作用。

骨关节炎是一种严重的关节退行性疾病，特征是软骨被破坏，大约有20%～30%的成年人受其影响[46]。AU可以抑制IL-1β诱导的软骨细胞内活性氧簇(ROS)产生，降低氧化应激反应，抑制软骨细胞凋亡；并显著提高OA小鼠的蛋白多糖水平，减轻关节软骨的侵蚀，保护小鼠关节软骨，减缓骨关节炎进程[21]。Wang等[13]研究发现：AU可以显著抑制大鼠软骨细胞中MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS和COX-2的基因和蛋白表达。进一步研究发现：AU可以抑制IKKα的磷酸化，从而抑制NF-κB p65的核转位，进而抑制下游炎症因子的表达，降低细胞内炎症反应，保护软骨细胞[13]。此外，AU联合透明质酸(HA)可以改善IL-1β诱发的人关节软骨细胞的细胞增殖和肥大转化，相对于单独使用HA或AU治疗，联合治疗可以进一步下调TNF-α、COX-2水平，纠正COL1A1和AGC水平，并上调TIMP-1的蛋白表达，促进软骨细胞的基质蛋白的产生；激活Nrf2信号通路，提高细胞的总抗氧化能力，治疗骨关节炎[47]。

此外，AU可以抑制MMP-3等细胞外基质降解酶的活性，以抑制IL-1β、TNF-α等促炎因子诱发的人髓核细胞(HNPCs)的细胞外基质降解，治疗腰椎间盘退变(IDD)。其与AU促进miR-140的mRNA表达，抑制CREB1、MMP的蛋白表达相关[48]。

2.5 对男性生殖系统的保护作用

不孕症发生率的增加已成为世界范围内的严重问题。男性不育占所有不孕病例的30%以上。遗传因素、内分泌失调、环境因素、药物副作用和糖尿病等多种因素可导致精子异常、精子数量减少或精子质量差，进一步诱发男性不育的发生[49-50]。睾丸是男性重要的生殖器官，能产生精子和分泌雄激素。男性精子的数量和质量与睾丸功能及形态密切相关。

杜仲是中国名贵的中药，具有壮阳补肾的作用，对男性生殖系统和生殖内分泌功能具有促进作用[51]。AU作为杜仲主要活性成分，对男性生殖系统也有保护作用。Ma等[3]研究发现：AU可以有效治疗雷公藤甲素造成的小鼠睾丸损伤和生精功能障碍，给药治疗两周后，小鼠睾丸质量和形态、精子数量及血睾屏障完整性明显恢复。进一步研究发现：AU能够诱导Nrf2的激活和核转位，促进抗氧化酶和II相解毒酶的表达，抑制活性氧所介导的PERK/CHOP和JNK依赖的凋亡信号通路的激活，降低睾丸支持细胞的凋亡率，发挥保护睾丸组织的作用。

2.6 抗肿瘤作用

早期研究报道，AU对慢性粒细胞白血病有微弱的抗白血病活性[52]。然而，Kim等[53]对人类髓样白血病细胞系(K562)研究发现：AU对这些细胞的作用不明显，但其水解产物具有明显的细胞毒性作用，可以诱导Caspase-3的活化，诱导细胞凋亡。进一步研究发现：AU的水解产物可以抑制JAK2和c-Src的活化，减少白血病融合基因Bcr-Abl的磷酸化，降低STAT3的活性，以促进K562细胞的凋亡[53]。

此外，Hung等[54]研究发现：AU可以通过上调p53和p21蛋白的表达，阻断G(0)/G(1)相的细胞周期进程，以抑制人的非小细胞肺癌细胞系(A549)的增殖，并且还可诱导Fas/FasL系统，以促进A549的凋亡。

2.7 内脏保护作用

光感受器的功能障碍和退化是导致视力下降的主要原因。Jung等[55]研究发现：AU可以显著恢复视网膜电图中a波和b波振幅，抑制感光细胞凋亡和氧化性DNA损伤，从而抑制视网膜病变，保护视力。此外，Kang等[15]研究发现：桃叶珊瑚属提取物(AJE)及其活性成分AU具有改善干眼症的作用。AJE和AU可以提高眼泪滴数，恢复角膜。其机制可能是抑制角膜细胞的凋亡和炎症因子的蛋白表达。

NAFLD是最常见的慢性肝病。Shen等[10]研究发现：AU可以减少NAFLD小鼠体内总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)、髓过氧化物酶(MPO)、IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量，增加SOD、高密度脂蛋白(HDL)的含量。进一步研究发现；AU通过促进ACC、AMPKα、AMPKβ和AKT的磷酸化，以促进Nrf2和PPAR核转位，提高抗氧化酶的蛋白表达，降低睾丸内氧化应激反应和炎症反应，减少小鼠体内脂质的积累。此外，Lee等[56]研究发现：AU可以增强溶酶体活性，调节BAX的溶酶体定位，抑制高脂饮食动物模型中的血脂异常。

AU对LPS诱导的急性肺损伤(ALI)也有一定的治疗作用。AU可以减轻肺组织病理损伤，降低损伤评分，显著减少原发性肿瘤(BALF)总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞数，显著降低乳酸脱氢酶(LDH)活性和总蛋白含量[57]。此外，Qiu等[58]研究发现：给药治疗30 d后，小鼠体内MDA和O2-含量明显降低，炎症反应明显减少。进一步研究发现：AU通过抑制NF-κB信号通路，减少LPS诱导的炎症因子的释放；以及通过诱导抗氧化酶的表达，以达到通过诱导AMPK 信号通路和促进转录因子Nrf2核转位，降低肺内氧化反应，改善肺损伤，提高小鼠存活率。肺纤维化是一种严重威胁生命的恶性疾病，其特征在于进行性呼吸困难和肺功能恶化。给药治疗21 d后，肺纤维化小鼠呼吸频率得到降低，肺动力顺应性得到增加。此外，肺内胶原蛋白的沉积以及肺内炎症反应减少，纤维细胞的增殖和分化被抑制[59]。

2.8 其他保护作用

桃叶珊瑚苷药理学活性及潜在分子机制的总结见表1。另外，紫外线B(UVB)辐射会在细胞和皮肤中诱导ROS的生成，引起氧化应激反应，导致光老化和癌症。AU可以显著降低UVB诱导的人类角质形成细胞系(HaCaT)内氧化应激反应，降低脂质氧化标志物的含量，提高CAT活性，显著抑制MMP-1的mRNA和蛋白表达以及衰老相关的β-半乳糖苷酶活性[60-61]。