循环MALAT1、miR-22表达与老年慢性心力衰竭患者心室重构的相关性分析

闫丽，李维，吕佳新

慢性心力衰竭（CHF）是指由于心肌梗死、心肌病或血流动力学负荷过重等原因造成心肌损伤，引起心肌结构和功能的改变，导致心室泵血或充盈功能低下的临床综合征，临床表现为呼吸困难、无力和液体潴留[1]。随着人口老龄化发展，老年CHF患者已成为CHF的主要发病群体。研究发现，左室重构（LVR）对CHF的发生、发展和临床转归起到重要作用[2]。临床上虽可通过彩色超声多普勒评价心室重构及心功能，但无法反应CHF的致病原因及机体情况。转移相关的肺腺癌转录本1（MALAT1）是一种被广泛研究的核限制性长链非编码RNA（LncRNA），能够促进心肌细胞凋亡、加重心肌纤维化及心肌梗死后心室重构，在心力衰竭、心肌梗死等心血管疾病中起到重要作用[3]。微小RNA-22（microRNA-22，miR-22）是心脏中表达最丰富的微小RNA，研究发现，在缺氧心脏祖细胞模型中，miR-22水平下降，过表达miR-22有助于缺氧心脏祖细胞的恢复[4]。此外，miR-22也是LncRNA MALAT1的作用靶点，与LncRNA MALAT1呈负相关[5]。因此，本研究通过检测老年CHF患者血清中MALAT1及miR-22表达水平，分析其与老年CHF患者发生LVR的相关性，期望为老年CHF发生LVR的临床诊治提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组选取2017年3月～2018年2月于阜新市第二人民医院接受治疗的CHF患者142例为研究对象（CHF组），其中男性75例，女性67例，年龄61～83岁，平均年龄（67.64±7.12）岁，依据美国纽约心脏病协会（NYHA）心功能分级[6]标准对CHF患者进行分级，分为Ⅰ～Ⅱ级45例，Ⅲ级49例，Ⅳ级48例。另选取同期健康体检者150例为对照组，其中男性81例，女性69例，年龄62～85岁，平均年龄（69.85±9.15）岁。两组年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。收集受试者性别、年龄、吸烟史、饮酒史、体质指数（BMI）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）等一般资料。纳入标准：①所有受试者年龄≥60岁；②符合《2016年欧洲心脏病学会急慢性心力衰竭诊断与治疗指南》标准[7]。排除标准：①急性ST段抬高型心肌梗死、肺栓塞、缩窄性心包炎、心肌炎；②曾进行过冠状动脉（冠脉）支架置入等心脏手术者；③合并恶性肿瘤者；④合并急、慢性感染病者；⑤患有复发、难治性室性心律失常；⑥近期有脑血管事件或重大外伤。本研究获得我院伦理委员会批准，研究对象家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器低温高速离心机、Nano Drop 2000（美国Thermo Scientific公司），荧光实时定量PCR仪（美国Applied biosygtems公司），Trizol试剂（美国Invirotrogen公司），逆转录试剂盒（北京天根生物科技公司），SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒（大连TaKaRa公司），-80℃超低温冰箱（美国Thermo公司），Milli-Q超净水净化系统（美国Millpore公司），qRT-PCR分析仪购自日本Olympus公司，彩色多普勒超声心动仪购自美国惠普公司，引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集CHF组在入院后次日清晨、对照组于体检当日空腹抽取静脉血5 ml，静置30 min，室温3000 rpm/min，离心15 min，吸取上清液分别装入EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测受试者血清中MALAT1、miR-22表达水平按照Trizol法提取受试者血清样本中总RNA，分光光度计测总RNA纯度及浓度，根据逆转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。参照SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒说明书进行qRT-PCR反应，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）及U6基因为内参，MALAT1、miR-22、GAPDH、U6引物序列见表1。反应条件为：95℃，10 min；40 个PCR循环（95℃，10 s；60℃，60 s，72℃，15 s）。采用2-ΔΔCt方法计算受试者血清中MALAT1、miR-22相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 超声心动图检查由超声科专职医师采用英国Philips iE33型彩色多普勒超声心动仪对患者进行三维超声心动图检测，X3-1探头，频率1～3 MHz，TomTec公司4DLV analysis CAP2.5分析软件的三维工作站。患者左侧卧位，连接心电图，根据美国超声心动图学会推荐方法对反映患者LVR的指标进行检测，测定并记录左室重量指数（LVMI）、左室射血分数（LVEF）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室舒张末期室间隔厚度（IVST）、左室后壁厚度（PWT）、左室舒张末期内径（LVEDd）。根据Devereux等[8]公式直接计算LVMI=左室质量（LVM）/体表面积（BSA），其中LVM=1.04[（IVST+PWT+LVEDd）3-LVEDd3]-13.6；BSA=0.006×身长（cm）＋0.013×体重（kg）-0.153。所有参数均测量5个心动周期，取其均值。

1.4 统计学分析利用SPSS 22.0进行统计学分析，计数资料采用n（%）表示，组间比较采用卡方检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较行t检验。采用Pearson法分析血清MALAT1、miR-22水平与LVR指标LVMI、LVEF、LVEDV相关性分析；以老年CHF患者LVR敏感指标指标LVMI值为因变量，以血清TC、TG、LDL、MALAT1、miR-22为自变量，进行多元线性逐步回归分析。以P＜0.05，为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象一般资料比较对照组与CHF组性别、年龄、吸烟、饮酒人数和BMI相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，CHF组TC、TG、LDL水平明显降低（P＜0.05），表2。

表2 两组研究对象一般资料比较

2.2 两组血清中MALAT1、miR-22表达水平比较与对照组相比，CHF组心功能Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级血清中MALAT1表达水平依次升高（P＜0.05），miR-22表达水平依次降低（P＜0.05），表3。

表3 两组血清中MALAT1、miR-22表达水平比较

2.3 两组超声心动图LVR指标LVMI、LVEF、LVEDV水平比较与对照组比较，CHF组心功能Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级患者LVMI、LVEDV水平显著升高（P＜0.05），LVEF水平显著降低（P＜0.05）；与Ⅰ～Ⅱ级比较，CHF组心功能Ⅲ级、Ⅳ级患者LVMI、LVEDV水平显著升高（P＜0.05），LVEF水平显著降低（P＜0.05）；与Ⅲ级比较，CHF组心功能Ⅳ级患者LVMI、LVEDV水平显著升高（P＜0.05），LVEF水平显著降低（P＜0.05），表4。

表4 两组超声心动图LVR指标LVMI、LVEF、LVEDV水平比较

2.4 血清MALAT1、miR-22水平与LVR指标LVMI、LVEF、LVEDV相关性分析Pearson法分析相关性显示，CHF组患者血清MALAT1水平与LVMI、LVEDV呈正相关（P＜0.05），与LVEF呈负相关（P＜0.05）；血清miR-22水平与LVMI、LVEDV均呈负相关（P＜0.05），与LVEF呈正相关（P＜0.05），表5。

表5 血清MALAT1、miR-22水平与LVR指标LVMI、LVEF、LVEDV相关性

2.5 老年CHF患者LVR指标LVMI多元线性逐步回归模型分析结果显示，TC、TG、LDL回归容忍度＜0.1，MALAT1、miR-22回归容忍度＞0.1，回归系数方程：LVMI=β0+β1×MALAT1+β2×miR-22（β0是截距85.357，β1、β2是回归系数），得到血清MALAT1和miR-22的效应值分为为1.67和0.95，纳入模型的2个自变量MALAT1、miR-22对LVMI值的影响均有统计学意义（P＜0.05），表6。

表6 老年CHF患者LVR指标LVMI多元线性逐步回归模型分析

3 讨论

CHF是一种以心脏结构改变或功能异常造成心室充盈和射血能力降低的复杂临床综合征，也是多种心脏疾病的严重和终末阶段，发病率高，尤其是老年CHF患者，一般病程较长，可能长期患有心肌损伤、高血压等疾病，预后较差[9]。心室重构是心肌细胞和细胞间基质成分在特定刺激下发生的心室僵硬度增加、心肌收缩力降低的变化，是CHF的重要临床病理基础，临床上心室重构的改变主要由心室内径和心肌室璧厚度决定[10]。监测老年CHF患者心室重构程度对减缓心室重构病变进程，改善老年CHF生活质量具有重要意义。

MALAT1是LncRNA的重要成员，也被称为核富集常染色体转录本2，其编码基因位于染色体11q13.1，人MALAT1转录本序列长约8 kb，未用于编码蛋白质的开放阅读框。MALAT1是一种高度保守的LncRNA，其基因组序列3’末端5 kb左右人鼠同源性高达90%，这提示其在进化过程中具有重要作用[11]。MALAT1主要位于核斑，通过调节基因的转录、干扰mRNA的切割，调节表观遗传变化或通过充当竞争性内源RNA，参与调控胚胎发育、肿瘤进展、心血管重塑、肝脏纤维化、组织炎症和其它生理和病理过程[12]。miRNA是一种短链非编码RNA，通过与靶基因特定区域结合降解靶基因，使靶基因的表达降低，实现转录后的调控作用[13]。研究显示，miR-22具有抗凋亡的作用，参与心肌纤维化、心肌肥大和重构，与心衰、肿瘤的发生密切相关[14]。本研究发现，与对照组比较，CHF组心功能Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级患者血清中MALAT1表达水平依次升高，miR-22表达水平依次降低。提示MALAT1及miR-22的表达水平的改变可能与老年CHF的发病有关，并随疾病进展其表达水平明显改变。

LVMI、LVEF、LVEDV是评价左心室的质量的重要参数，LVEF是指每搏心输出量占左心室舒张末容量的百分数，是临床心脏影像学最重要且最常用的参数，与心脏病的死亡率密切相关，可以预测愈后，衡量治疗效果，是心脏病诊断治疗的最重要指标[15]。本研究发现，与对照组比较，CHF组心功能Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级患者LVMI、LVEDV水平依次升高，LVEF水平依次降低。提示CHF患者随心功能等级的增加，心脏发生了更严重的LVR，并伴随严重的心脏收缩功能降低和心功能障碍。研究发现，MALAT1在体外过表达增强了动脉平滑肌细胞活性，并造成自发性高血压大鼠严重的心肌纤维化，在高血压大鼠心脏重构中具有重要作用[16]。miR-22通过靶向抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）基因，减少冠心病大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡及下调促炎症因子的表达，发挥对大鼠心肌微血管内皮细胞的保护作用[17]。本研究经Pearson法分析显示，CHF组患者血清MALAT1水平与LVMI、LVEDV呈正相关，与LVEF呈负相关；血清miR-22水平与LVMI、LVEDV均呈负相关，与LVEF呈正相关。提示血清MALAT1、miR-22水平降低可能在LVR过程中发挥重要作用，猜测可能是MALAT1及miR-22水平改变加重了心脏纤维化，进而造成心脏器质性改变，但其具体机制有待进一步研究。本研究对CHF患者LVMI值进行多元线性逐步回归模型分析，血清MALAT1、miR-22对LVMI值的影响具有统计学意义。提示血清MALAT1水平升高、miR-22水平降低与CHF患者LVR及心功能损伤有关，可能作为反映CHF患者LVR及心功能损伤的重要指标，对临床评估CHF患者LVR有一定意义。

综上所述，老年CHF患者血清MALAT1水平升高，miR-22水平降低，与LVR的发生密切相关，具有一定预测价值，可能作为临床诊治老年CHF患者LVR及病情严重程度的血清学标志物。本研究采用多元线性回归分析，但在回归分析中，选用何种因子和该因子采用何种表达式只是一种推测，影响了该因子的多样性和某些因子的不可测性，而血清MALAT1、miR-22仅是影响LVR的两个因子，还需结合下游靶基因或蛋白共同探究CHF患者LVR致病机制，这也是本研究的局限性及不足之处。