2014—2017年甘肃省结核分枝杆菌耐药监测结果分析

李晴 司红艳 马玲 李银花 辜吉秀 王冬冬 何健

目前，我国仍是全球结核病及耐药结核病高负担国家[1]，科学开展耐药监测是做好耐药结核病防控的重要基础。2004年8月至2006年8月，甘肃省仅开展了临夏州、甘南州、定西市3个地区的结核病耐药性基线调查和评价[2]，结果代表性有限。2007—2008年，我国卫生部组织开展了全国结核病耐药性基线调查[3]，甘肃省仅1个调查点，也难以评估全省耐药情况。为掌握当前甘肃省结核病耐药现状，我省以国家结核病耐药性基线调查方案为基础，于2014年9月1日至2017年8月31日开展了全省结核病耐药监测，并依据《中国结核病信息管理系统》2017—2019年甘肃省年平均登记患者数及患者耐药率(95%CI)对全省每年新发耐药肺结核患者数进行估算。

对象和方法

一、研究对象

1.调查对象：参照全国结核病耐药性基线调查方案[3]和世界卫生组织/国际防痨和肺病联合会(WHO/IUATLD)结核病耐药监测指南[4]的要求，于2014年9月1日至2017年8月31日采用整群分层等比例随机抽样方法，选取甘肃省30家县级结核病诊疗机构作为监测点[4]。排除痰涂片抗酸染色镜检阴性、调查期间正在接受抗结核治疗或不同意接受调查者，对15岁以上培养阳性的初、复治肺结核患者分离株进行初步菌种鉴定及10种抗结核药品[异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(Sm)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、氧氟沙星(Ofx)、卷曲霉素(Cm)、丙硫异烟胺(Pto)、对氨基水杨酸钠(PAS)]比例法表型药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。所有入组患者均填写知情同意书，并由门诊医生填写《结核病耐药性监测患者信息表》[3]以核实患者病史及医疗记录。

2.样本量测算：按照横断面调查的统计学要求，按无限总体样本量进行估算，计算公式为n=[Uα2×P(1-P)]/d2×duff(n：设计需样本量；Uα：可信度；P：利福平耐药率；d：容许误差；duff：设计效应)。以初、复治患者利福平耐药率为7%和30%、Uα为1.96、duff为1，以及利福平初治、复治、新登记初治涂阴培阳95%CI允许误差(精密度)分别为±1.4%、±4.8%、±2.8%计算，估算需纳入1817株临床分离株，初、复治患者分离株分别为1499株和318株；考虑培养污染、非结核分枝杆菌、菌株活性影响、后续药敏试验无结果等情况可能导致有效样本量减少，故扩大15%的样本量，需纳入临床分离株2090株，初、复治患者分离株分别为1724株和366株。

3.实际纳入样本量：调查实际纳入2372株临床分离株，完成率为113.49%(2372/2090)。剔除309株培养污染、47株非结核分枝杆菌、68株转种及药敏试验失败、17株分离患者信息不全未纳入分析的菌株，最终纳入1931株，总完成率为106.27%(1931/1817)，其中初治患者分离株1815株，复治患者分离株116株，复治患者分离株数低于测算数。

二、研究方法

1.主要实验耗材：抗酸染液、分枝杆菌固体培养基、药敏试验及菌种初步鉴定培养基、磨菌及稀释套组、菌株保存管均由珠海贝索生物技术有限公司生产。

2.涂片抗酸染色镜检及分枝杆菌固体培养：严格按照《结核病实验室检验规程》[5]中萋-尼染色镜检和酸性改良罗氏培养基法操作。

3.菌株运送：30家县级结核病诊疗机构将培养阳性菌株送至市级疾病预防控制中心(简称“疾控中心”)，再由市疾控中心送省结核病参比实验室进行药敏试验。参与运送单位均按照要求办理菌株运送证。

4.比例法固体药敏试验及初步菌种鉴定：严格按照《结核病实验室检验规程》[5]进行操作。使用世界卫生组织推荐的10种药物作为监测药物。含药和对照培养基接种菌量分别为10-4mg和10-6mg。37 ℃培养4周后观察结果。当含药培养基上生长菌落数/对照培养基生长菌落数>1%，则判定为耐药。同时，将10-4mg菌液接种于对硝基苯甲酸(PNB)、噻酚二羧酸肼(TCH)鉴别培养基中，进行结核分枝杆菌、牛分枝杆菌及非结核分枝杆菌的初步鉴定。

5.质量控制：省结核病参比实验室对原培养阳性菌株进行传代培养，每批次药敏试验均使用国家结核病参比实验室提供的敏感株(H37Rv)作为质控对照[5]。对污染、初次药敏试验失败菌株均进行重复试验。详细记录试验编号、患者姓名及纳入编号、药敏试验结果等，并与患者问卷信息(双人录入)进行匹配。对缺失数据查阅《中国结核病信息管理系统》进行补充。

6.耐药结核病分类：参照《耐药结核病化学治疗指南(2015)》[6]将耐药结核病分为单耐药结核病、多耐药结核病、利福平耐药结核病、耐多药结核病、广泛耐药结核病。

三、统计学处理

使用EpiData 3.1和SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计数资料使用“百分率[%，(95%CI)]及占比(%)”描述，耐药患者数≤5时不进行耐药率95%CI计算，组间差异的比较采用χ2检验；当最小理论值<5时，使用Fisher精确概率法。均以P<0.05为差异有统计学意义。每年新发各类型耐药肺结核患者数依据《中国结核病信息管理系统》2017—2019年甘肃省年平均登记的初治及复治患者数及患者耐药率(95%CI)进行估算。

结 果

一、总耐药情况

1931株分离株中，1424株对10种抗结核药品全部敏感，507株对1种及以上药品耐药，总耐药率为26.26%；其中，初、复治患者分离株对10种药品的总耐药率分别为25.45%和38.79%，男性和中部地区的初、复治患者总耐药差异均有统计学意义，且南部地区复治患者分离株总耐药率明显低于其他3个地区，见表1。1931株分离株对10种药品的任一耐药率前3位依次为INH(16.78%)、EMB(15.38%)和RFP(10.10%)，耐药占比分别为29.97%、27.47%和18.04%，且4种一线抗结核药品的耐药总占比达80.11%(866/1081)，见表2。

二、单耐药情况

1931株分离株中，220株为单耐药菌株，总单耐药率为11.39%；其中，初、复治患者分离株单耐药率分别为11.40%和11.21%，差异无统计学意义，且不同性别、年龄组、地区间的差异也均无统计学意义，见表3；对10种药品的单耐药率前3位依次为Sm(4.61%)、INH(3.31%)和Ofx(1.97%)，耐药占比分别为40.45%、29.09% 和17.27%，见表4。

三、多耐药情况

1913株分离株中，124株为多耐药菌株，总多耐药率为6.42%；其中，初、复治患者分离株多耐药率分别为6.23%和9.48%，差异无统计学意义，且在不同性别、年龄组、地区间的差异也均无统计学意义，见表5。124株多耐药菌株对10种抗结核药品有33种不同类型耐药组合，以INH+Sm的耐药率为最高(3.68%)，INH+Ofx+Sm和INH+Ofx次之(5株，0.26%)，其余30种组合的多耐药率均低于0.16%；其中，初、复治患者分离株的多耐药类型均以INH+Sm为主，多耐药率分别为3.64%和4.31%，耐药占比分别为58.41%和45.45%，见表6。

四、耐多药情况

1931株分离株中，163株为耐多药菌株，总耐多药率为8.44%。初、复治患者分离株耐多药率分别为7.82%和18.10%，差异有统计学意义；除40～59岁组和东部地区外，不同性别、年龄组和地区间，初、复治患者分离株耐多药率的差异均有统计学意义；在RFP耐药分离株中，耐多药分离株占83.59%(163/195)，初治患者耐多药分离株占全部耐多药分离株的87.12%(142/163)，见表7。163株耐多药分离株对10种抗结核药品有23种耐药类型，耐多药率前3位依次为INH+RFP+Sm(2.80%)、INH+RFP(2.02%)和INH+RFP+Sm+Ofx(1.04%)，耐药占比分别为33.13%、23.93%和12.27%，见表8。

五、广泛耐药情况

1931株分离株中，分离出8株广泛耐药菌株，总广泛耐药率为0.41%(8/1931；95%CI：0.13%～0.70%)。其中，初、复治患者分离株广泛耐药率分别为0.28%(5/1815；95%CI：0.03%～0.52%)和2.59%(3/116；95%CI：0.54%～7.37%)，差异有统计学意义(χ2=8.790，P=0.000)。

六、每年新发耐药肺结核估算

2017—2019年甘肃省结核病专报系统年均登记肺结核患者9904例，其中，初、复治肺结核患者分别为9636例和268例，按照本次监测各类型患者耐药率95%CI估算，甘肃省每年新发耐药、单耐药、多耐药、耐多药、广泛耐药肺结核患者分别为2341～2764例、973～1285例、503～747例、665～940例、5～70例。

讨 论

耐药结核病的产生和传播是当前结核病控制的重点，定期开展耐药监测对评价结核病控制效果、制定耐药结核病控制策略具有重要意义[4]。本次监测估算需纳入分离株1817株，最终纳入1931株，总完成率为106.27%，但复治肺结核患者分离株纳入数量(116株)明显低于测算数(318株)，认为主要是本次监测时间正处于结核病防治由疾病预防控制中心转向结核病定点医院的转型期，管理流程、转诊及报告责任均未能良好对接及落实，加之较多复治患者在此期间选择就诊于上一级医院或异地治疗，最终导致县级结核病定点医院复治患者登记数量明显下降。

结果显示，我省总耐药率明显低于国家耐药基线调查结果(39.12%)[3]，其中INH和RFP任一耐药率与国家耐药基线调查水平一致，但EMB、Ofx任一耐药率明显高于国家耐药基线调查，而Sm的耐药率远低于国家耐药基线调查[3]水平。对于10年间呈上升趋势的EMB耐药情况，认为可能与普通结核病2个月强化期的广泛使用，以及结核性胸膜炎、重症结核病、肺外结核、结核病并发艾滋病患者、单耐INH、单耐RFP结核病患者的治疗均全程使用EMB[7]有关；同时，对Ofx耐药率的上升则认为与该药品作为广谱抗感染药品在这10年间被各医疗机构广泛使用有关；而对耐药情况呈下降趋势的Sm，笔者认为可能主要与患者对其肌内注射的给药方式接受度较低，已不再用于目前的标准治疗方案[大多使用口服FDC(固定复合制剂)]，只能作为一线抗结核药物耐药的替代药物使用[7]有关。同时发现，4种一线抗结核药品的耐药占比达80.11%(866/1081)，而Km、Am、Cm、Pto、PAS这5种二线药品任一耐药率均较低，说明一线抗结核药品仍是我省主要的耐药种类。另外，甘肃省南部地区患者的耐药率明显低于其他3个地区，认为与该地区居住人群分散、人员流动少有关，进一步说明重视流动人口较多地区的耐药监测及防控仍是降低耐药结核病传播的关键。

初治肺结核患者的总耐药水平是评价结核病控制效果的重要指标[4]，也是直接反映一个地区近期耐药结核分枝杆菌传播严重程度的重要指标。本次监测显示，初治患者总耐药率明显低于国家结核病耐药基线调查结果[3]，但高于同期贾庆军等[8]和陈求扬等[9]对杭州市和福建省的结果；而初治患者4种一线抗结核药品(INH、RFP、EMB、Sm)的总耐药率(22.64%)与2009年司红艳等[2]的监测结果(20.60%)相似，说明甘肃省初治患者的耐药率虽低于10年前的全国结核病耐药基线调查结果，与本省2009年的耐药监测结果相近，但与同期其他省市的耐药结果相比较，仍处于较高水平，提示甘肃省耐药结核病的传播仍较严重。

复治肺结核患者的耐药情况反映了结核病治疗与管理的水平[4]。复治患者分离株总耐药率低于国家耐药基线调查结果[3]，但与同期贾庆军等[8]对杭州市和陈求扬等[9]对福建省的调查结果相近；而对4种一线抗结核药品的耐药率则明显低于本省司红艳等[2]的监测结果，提示甘肃省复治患者的总耐药率呈下降趋势，可能与甘肃省对复治患者的治疗与管理水平及重视程度提升有关，但不排除与较多的耐药复治患者因就诊于上一级或外省市医院，而使得本次监测的县级结核病定点医院未能登记相关。监测还发现，20～39岁和60岁及以上年龄组复治患者的耐药率均较高，分别达44.83%和41.46%，认为20～39岁年龄段为求学及务工主要人群，工作学习压力大，时间紧张，对疾病耐受度高，导致其主动就诊及治疗依从性较差[10]，极易形成耐药结核病，考虑甘肃省为劳务输出大省，应充分重视这一群体可能引起的耐药结核病传播风险；而60岁及以上年龄组人群的耐药率高可能与其复治患者占比较高(35.34%，41/116)、疾病暴露时间较长有关，也应重视该年龄组的耐药高发情况。

耐多药结核病患者以其治疗时间长、花费高、治愈率低成为结核病防治的新挑战[1]。本次监测发现，初治患者的耐多药率高于全国耐药基线调查水平[3]，耐多药患者占RFP耐药患者的83.59%，且初治患者中RFP耐药占9.31%，均高于《2020年全球结核病报告》水平(分别为74.0%和3.3%)[1]；初治耐多药分离株占总耐多药分离株的87.12%，复治患者耐多药率低于全国耐药基线调查结果[3]及2013年陈松华等[11]对浙江省的报道。说明甘肃省耐多药患者主要来源于初治患者，与梅建等[12]研究结果一致，提示甘肃省耐多药结核病传播风险高，应重视初治患者的耐药筛查，以发现更多的耐多药患者并纳入治疗管理。

同时，本次监测还发现，初复治患者分离株的单耐药率和多耐药率均不高，低于国家耐药基线调查结果[3]。但从初治患者中分离出5株广泛耐药菌株，提示甘肃省结核病耐药防控形势仍然严峻，希望能对耐药肺结核患者的集中隔离治疗及外出旅游限制做出具体规定，阻断耐药及广泛耐药结核病的传播。

综上所述，2014—2017年甘肃省结核病患者总耐药率虽低于2010年国家耐药基线调查结果，但高于同期其他地区，且耐药分布存在地区差异，耐药类型仍以耐一线抗结核药品为主，并以初治、青壮年患者为主，其引发的耐药传播风险应引起各级卫生部门高度重视。同时，也应对EMB和Ofx耐药率的上升趋势予以重视。