丹参种子活力快速测定方法的建立及其与萌发率的相关性

廖 芳， 任瑞花， 孔德英， 刘 伟， 冯 洁， 韩 艺， 李关荣

(1.天津海关动植物与食品检测中心， 天津 300461； 2.西南大学农学与生物科技学院， 重庆 400716；3.重庆海关技术中心， 重庆 401333)

种子的生活力即种子萌发的潜在能力，是衡量种子质量的重要指标之一[1-2]。种子活力测定是种子检验的重要环节，对种子引进、储藏、交换、播种等生产环节，都有十分重要的意义[3]。种子质量检验通常都采用发芽试验的方法，但发芽试验时间较长，还会受到水分偏差、病菌的侵入等因素的影响，导致结果不太可靠[4]。因此快速测定种子活力非常重要。目前，种子活力的快速测定方法主要有氯化三苯基四氮唑(TTC)法、红墨水(或酸性靛蓝)法、碘-碘化钾法、溴麝香草酚蓝(BTB)法等[5-7]。TTC法依赖于种胚呼吸脱下的氢使水溶性氯化三苯基四氮唑(TTC)还原为红色的脂溶性三苯甲腙(TTF)并附着在种胚表面而使活性种胚着色[8-9]，是标准的种子活力快速测定法；红墨水(或酸性靛蓝)法依赖于种胚活细胞的选择透性不透过红墨水(或酸性靛蓝)而使胚乳着上红(蓝)色[10-12]；碘-碘化钾法以测定种子主要储藏物质淀粉的丰度来快速测定种子的活力[3,13]；BTB法利用种胚活细胞呼吸作用放出的CO2扩散使得种粒周围环境的酸度增加而使酸碱指示剂BTB显现黄色[13]，其黄色越深则表明种子活力越强。不同特性(大小，成分、物理特性等)的种子，其适宜的快速测定活力方法也不同。彭子模等[13]研究表明，碘-碘化钾法对蓖麻、油葵、红花、向日葵、棉花等脂肪类种子生活力的快速测定效果较好, 而靛蓝染色法和碘-碘化钾反应法均不适合用作檀香种子生活力的快速测定[3]。

丹参为我国传统的大宗药材之一[14]，其功效包括活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痛等[15]。丹参种子为三棱状长卵形的小坚果，长度1.8～2.5 mm，宽1.1～1.6 mm[16]，不适合采用TTC法和红墨水(或酸性靛蓝)染色法来快速测定种子活力，因剥离暴露种胚及胚乳以观察种胚或胚乳着色情况极为困难，加之丹参种子的果皮表面存在大量粘性物质，包裹种子[17]，吸水膨胀使剥离种胚和胚乳更为困难。目前还未见丹参种子活力快速测定的方法报道。本研究采用BTB来建立丹参种子活力快速测定方法，并通过类原位萌发和常规萌发试验测定其发芽率，研究丹参种子BTB活力与萌发率之间的相关性。

1 材料与方法

1.1 材 料

本研究采用重庆市武隆区仙女山从四川省阿坝藏族羌族自治州红原县引进的白花丹参种子为材料(W-SCHY-W-1)。

1.2 方 法

1.2.1BTB法处理丹参种子的活力观测

取外观饱满、均一的丹参种子用温水浸泡10 h[17]，随机取吸胀种子200粒，整齐均匀排布于4个培养皿中(编号为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)，每皿50粒；另取吸胀种子50粒，煮沸20 min，作为对照组，置于编号为ck的培养皿中。将配置的含2% BTB的1%琼脂溶胶沿着玻棒缓缓倒入上述5个培养皿中，使之呈均匀的薄层覆盖种粒。将培养皿置于恒温(25～30 ℃)培养箱中培养，每隔1 h观察种粒周围蓝色基质的颜色变化；参照ck种粒周边的颜色，确定活力表现稳定的最适时间。统计4个重复培养皿中种粒周围的黄色荤圈出现情况，以出现黄色荤圈的总粒数的百分率快速确定种子活力百分数。

1.2.2类原位萌发试验

将上述经BTB试验3 h后的ck，Ⅰ～Ⅳ培养皿中的种粒分别取出，类原位(对位)转移至育苗盘ck，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ的相应位置，加入适量的蒸馏水。将育苗盘置于恒温培养箱中，在光照16 h/黑暗8 h，光照强度8 000 lx，恒温25 ℃下培养，在处理14 d后统计种子的萌发率。

1.2.3常规萌发试验

同上述方法进行浸种，随机取吸胀的种子250粒，其中200粒平均放在含有双层滤纸的4个培养皿中(编号Ⅰ～Ⅳ)，剩余的50粒种子煮沸20 min作为对照组(ck)，在培养皿中加蒸馏水，保持湿润，萌发条件和发芽率统计方法同上。

1.3 发芽率的估算及相关性分析、回归分析

丹参种子发芽率的测定参照国家《农作物种子检验规程与国际标准》中的相关规定[6]：

发芽率(%)=(发芽的总粒数/50)×100%。

利用Excel软件进行快速测定活力与发芽率的相关性分析和回归分析。

2 结果与分析

2.1 BTB-琼脂凝胶法处理丹参种子其活力的表现

以煮沸20 min的丹参种子为对照，在含有新制的2% BTB的琼脂凝胶基质(1%)的培养皿中播种对照和测试丹参种子，观察种子周围凝胶基质的颜色变化情况。在BTB试验的1～3 h内，ck丹参种子外围基质一直都呈淡蓝色层晕圈，而试验组的4次重复(Ⅰ～Ⅳ)试验中，部分种子外围基质呈淡黄色晕圈，且随处理时间延长，有的黄色荤圈逐渐加深，部分种子仍呈淡蓝色，且在处理3 h后比较稳定(图1 A)。BTB处理3 h种粒周围基质的局部放大观察表明，ck煮死种子周围出现淡蓝色，而测试组的种子周围呈现不同程度的黄色，说明其活力存在差异(图1 B)。因此，确定BTB法对丹参种子活力估算最适时间为3 h，此时通过统计出现黄色荤圈的种子粒数，可快速测定丹参种子的活力。

注：A为接种在含BTB-琼脂凝胶基质的培养皿中丹参种子周围颜色变化；B为局部放大情况；ck为对照(煮沸20 min杀死种子);Ⅰ～Ⅳ为4次重复试验。

2.2 BTB法估算丹参种子活力

BTB试验不同时间(1～3 h)，估算具有活力的丹参种子活力百分率(表1)。随时间的延长，显示具有活力的种子数逐渐增高，直到3 h时达到最高。

表1 BTB法估算四川红原丹参种子活力

2.3 类原位和常规萌发发芽率

BTB处理3 h后进行的类原位萌发试验结果表明，测试组中平均发芽率为53%，同时观察到黄色荤圈颜色越深的种子，在类原位萌发中表现出萌发越快的特征；常规萌发试验测定组平均发芽率为70%，而ck均无萌发(表2)。常规萌发的萌发率均显著高于类原位萌发的萌发率；测试组中的4个重复，其类原位萌发率和常规萌发率均存在较大差异。

表2 四川红原丹参种子类原位和常规萌发的发芽率

类原位萌发和常规萌发过程观察表明，常规萌发的萌发率均高于类原位萌发；与常规萌发比较，类原位萌发的小苗较纤细，根较细长，茎较短，子叶不够粗壮，可能经BTB法测定活力后的种子，其萌发受到BTB的一定程度的影响，这有待进一步研究确认。

2.4 丹参种子BTB法快速测定活力与其类原位和常规萌发的相关性分析

根据本研究建立起的BTB法快速测定丹参种子活力，结合类原位和常规萌发的萌发率结果的相关性分析可知，类原位萌发发芽率(y)与BTB法估算的种子活力(x)的直线回归方程为y=0.983 5x+1.859 5，R2=0.996(图3 A)；常规萌发发芽率(y)与BTB法估算的种子活力(x)之间的回归方程为y=0.347 1x+51.95，R2=0.972(图3 B)。表明丹参种子萌发率与BTB法测定活力估算值之间存在显著正相关。

图3 BTB法估算种子活力与类原位和常规萌发发芽率的线性回归方程散点图

3 结论与讨论

李晖[18]采用TTC法快速测定高原植物种子活力，用时较短、简单快捷, 结果可靠。张薇等[5]设置3个浓度的红墨水溶液和3个浓度的TTC溶液，对10个粳稻品种试验材料分别浸种4.5、12、24 h以快速测定种子的生活力，结果表明，TTC染色法比红墨水染色法测定结果更准确。彭子模等[13]比较了4种不同种子活力测定方法，表明TTC法效果较好，方法简便，适用性广，对淀粉含量较多的种子测定效果较好，而对于较小的种子，BTB法则更为方便。

本研究前期发现，丹参种子在含0.1%BTB的凝胶中显现的淡黄色晕圈颜色较浅，主要是因为丹参种子的呼吸强度比较弱，可能还与其种子外有层胶质影响二氧化碳的扩散有关。后来通过BTB的浓度增加至2%，效果较好。 丹参种子在自然条件下的发芽率较低，只有30%～40%，且出苗不整齐[19]。但孙群等[15]通过研究陕西优良农家品种的丹参种子后发现，当年的新种子发芽率达75%以上。

本研究发现，当年产的四川红原白花丹参种子其类原位萌发试验的平均发芽率为53%，而BTB法估算具有活力种子的平均百分率为52%，估算结果与实际试验结果大致相同。这表明，BTB法可以快速测定丹参种子的活力。常规萌发试验的种子发芽率(平均达70%)总体高于类原位萌发试验的种子发芽率，可能是因为类原位萌发挑取的种子带有残余的BTB琼脂凝胶或因种子部分损伤所致。本研究采用较高浓度的BTB(2%)可能对类原位种子萌发有某种不利的影响，这有待于进一步研究确认。类原位萌发发芽率与BTB法估算种子活力的直线回归方程为y=0.983 5x+1.859 5，R2=0.996；常规萌发发芽率与BTB法估算的种子活力之间的回归方程为y=0.347 1x+51.95，R2=0.972。表明，丹参种子类原位和常规萌发率与本研究建立的BTB法测定活力估算值之间存在显著正相关。BTB法估算种子活力与类原位萌发结果更接近，而与常规萌发发芽率结果有些许偏差，也可能是因为类原位萌发采用的就是快速活力测定的种子，而常规萌发采用的则是另取的同批次丹参种子。