增施有机肥对谷子耕地土壤细菌的影响

于宝海 王亚军 贾洪男 赵俊国 孙奎仓 张 婷

（1承德市土壤肥料工作站 河北 承德 067000；2丰宁县农业农村局 河北 承德 067000；3承德市农林科学院 河北 承德 067000）

随着农业科技的发展，农药和化学肥料被广泛应用于农业生产中，但药物残留对农产品和环境造成严重影响。为保证粮食和环境安全，农家肥和有机肥的施用显得尤为重要。研究表明，增施有机肥不仅能为作物生长提供营养，提高作物抗病能力，而且还能够提高土壤肥力，改善土壤环境，为绿色农业可持续发展提供有利条件[1]。

丰宁满族自治县位于河北省北部，地处北纬40°35′～42°0′，东经115°14′～117°24′，海拔400～1 500 m，属冀北山区。近年来，由于气候不断恶化，降水量明显减少。而谷子作为一种重要的谷类作物，具有耐干旱、耐贫瘠和抗逆性强等特点，是该县具有发展前景的农作物。早在2015年丰宁县委县政府就把有机农业产业作为主导产业发展，并把有机谷子的生产作为重点项目来抓。有机谷子生产过程中不得使用任何化学肥料，必须使用有机肥。本试验旨在探究增施商品有机肥对谷子耕地土壤微生物的影响，分析施肥前后土壤微生物群落结构变化，为丰宁满族自治县有机谷子种植过程中合理施肥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况。试验地位于丰宁县黄旗镇有机农业土壤培肥改良利用技术示范区，土壤类型为棕壤。试验耕地已连续3年施用农家肥(腐熟牛粪)，有机质含量为55.5%，氮含量为1.57%，磷含量为0.085%，钾含量为0.32%，施用量为1 800 kg/亩。有机肥为商品有机肥，有机质含量≥45%，氮磷钾含量≥5%。种植谷子品种为山西红谷。

1.2 试验设计。根据地区农业生产的施肥水平及土肥站测土配方要求，在有机谷子生产过程中进行农家肥和商品有机肥的配施，以改善土壤结构，提高土壤肥力。试验设4个处理：对照组(gz1)，只施农家肥、不施商品有机肥，用量1 800 kg/亩；处理组(gz2)，施商品有机肥350 kg/亩+对照等用量农家肥；处理组(gz3)，施商品有机肥700 kg/亩+对照等用量农家肥；处理组(gz4)，施商品有机肥1 000 kg/亩+对照等用量农家肥。播种前以农家肥作底肥，中耕前追施商品有机肥。小区面积30 m2，播种行距45 cm，采用随机区组排列。各处理除施肥水平不同外，田间管理一致。

1.3 土壤样品采集及预处理。于谷子成熟期，以五点取样法采集各处理组土壤样品，放于密封袋中，带回实验室，备用。称取200～500 mg的样品，放入灭菌离心管中，加入1xPBS溶液，震荡混匀后置于室温下，10000r/min离心3min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上1 min，直至没有液体流出。采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取土壤样品DNA。

1.4 土壤微生物分类检测。DNA样品质检合格后，利用细菌16SV3-V4区通用引物341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)进行PCR扩增。反应体系：2×HieffRobust PCR Master Mix 15μL，Bar-PCRprimer F 1μL，Primer R 1μL，PCRproducts 10～20ng，加水补足至30μL。反应条件：94℃3min，94℃30 s，45℃20 s，65℃30 s，5个循环；94℃20s，55℃20s，72℃30s，20个循环；72℃5min。第2轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物。反应体系：2×Hieff○R Robust PCR Master Mix 15 ° L，Primer F 1μL，Index-PCRPrimer R 1μL，PCRproducts 20～30 ng，加水补足至30μL。反应条件：95℃3 min，94℃20s，55℃20s，72℃30s，5个循环；72℃5min。利用Qubit3.0荧光定量仪进行文库浓度测定，应用Illumina Miseq平台进行微生物分类测序，测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 门水平土壤细菌群落差异。高通量测序结果分析显示，4处理在门水平上，除去未鉴定类群和其他(将相对丰度＜1%的类群归为其他)，共获得11个细菌门(图1)。变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主要优势细菌门。由图1可知，施商品有机肥对土壤细菌门水平相对丰度产生了影响。变形菌门和放线菌门在对照处理中相对丰度最小，说明增施商品有机肥能够增加土壤中变形菌门和放线菌门的数量，且施肥量越多相对丰度越大。酸杆菌门在对照处理中相对丰度最大，说明增施商品有机肥降低了土壤中酸杆菌门的数量，这与武晓森[2]等人的研究结果相一致，未施肥处理中放线菌门、变形菌门丰度明显低于施肥处理，但酸杆菌门在对照处理中比例较高。研究表明，酸杆菌门生长速度较慢，当土壤营养或结构发生变化时，生长较快的微生物将取代生长较慢的酸杆菌门，从而使酸杆菌门丰度降低[3]。另外，非优势菌门中蓝细菌门(Cyanobacteria)相对丰度表现为对照处理中最高，说明增施商品有机肥降低了蓝细菌门的相对丰度。研究表明，蓝细菌在贫瘠土壤固氮、固碳中发挥作用[4]，商品有机肥中含有氮磷钾和有机质，施肥后土壤肥力增加，从而使土壤中蓝细菌相对丰度降低。

图1 细菌门水平分布图

2.2 属水平土壤细菌群落差异。高通量测序共获得细菌属水平类群25个，包括未鉴定类群和其他(相对丰度＜1%)，4个处理中主要优势菌属种类并无差异，但各优势菌属相对丰度存在差异(图3)。主要优势类群有鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Gp6、Gp4、芽单胞菌 属(Gemmatimonas)、溶 杆 菌 属(Lysobacter)、WPS-1_genera_incertae_sedis、Aridibacter、Gp3、Gp16、节杆菌属(Arthrobacter)、戴沃斯菌属(Devosia)等11个细菌属。由图3可知，溶杆菌属、Gp16和戴沃斯菌属在增施商品有机肥后相对丰度增加，其中Gp16的相对丰度随着商品有机肥的增加而增加，溶杆菌属在gz2中相对丰度最大，戴沃斯菌属在gz3中相对丰度最大。而Aridibacter和Gp3在施商品有机肥后相对丰度降低。研究表明，溶杆菌属可以产生具有抗菌和裂解活性的次级代谢产物，在植物病虫害防治及增强土壤抵抗力上具有重要作用[5]，戴沃斯菌属可以与水生豆科类植物Neptunia natans(L.F.)Druce共生形成独特的固氮结节[6]。

图3 细菌属水平分布图

3 结论与讨论

本试验结果显示，4个处理土壤细菌优势门和优势属相同，只是在相对丰度上存在差异，说明增施商品有机肥尽管增加或降低了一些细菌的相对丰度，但并未引起土壤细菌群落结构的差异。与只施农家肥相比，在门水平上，增施商品有机肥能够明显增加土壤中变形菌门和放线菌门的相对丰度，降低酸杆菌门和蓝细菌门的相对丰度；在属水平上，增施商品有机肥增加了土壤中溶杆菌属、Gp16、戴沃斯菌属、WPS-1_genera_incertae_sedis等细菌属的相对丰度，降低了Aridibacter和Gp3的相对丰度。但细菌门属的相对丰度增加或降低与施肥量并未表现出明显的线性关系，推测可能由于施肥时间相对较短，而土壤微生物的演变需要一定的时间。

施肥是土壤微生物演变的重要驱动因子之一。与化肥相比，有机肥的时效性和持久性更好。一方面，有机肥中含有氮磷钾和有机质等营养物质，能直接增加土壤养分，促进谷子生长；另一方面，有机肥增加了外部碳源的输入，有助于土壤微生物的生长繁殖，增强了微生物的代谢活动[7]，改善了土壤结构，从而进一步促进谷子根系营养的吸收和地上部分的生长。因此，在实际生产中，科学合理施用有机肥和农家肥，有利于调节土壤微生物群落结构，改善土壤环境，促进农业产业可持续发展。