儿童肺炎支原体感染的两种检测方法比较

周仁希 林晓伟 陈东 周俊 吴亦栋 叶蓓

肺炎支原体（MP）是引起儿童呼吸道感染的常见病原微生物之一［1］，在儿童呼吸道感染中约占30%。临床症状可从轻微的支气管炎到重症肺炎，严重感染可导致死亡，MP 也能引起多种呼吸道外并发症，其中属消化系统症状最常见。MP 感染在≥5 岁肺炎患儿中，其感染率可达50%［2］，在因呼吸道感染的住院患儿中约>19.1%［3］。由于支原体肺炎（MPP）早期临床表现多样、影像学检查无显著特征，因此，实验室特异、快速检测MP 对儿童MP 感染临床诊断以及监测患儿预后具有重要的意义。本文通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测MP 抗体IgM 与实时荧光定量PCR 法（RT-PCR）检测MP 核酸的对照分析，探讨MP 感染的两种不同实验室检测方法在临床诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018 年1 月至12 月杭州市儿童医院同时行肺炎支原体抗体IgM 检测及肺炎支原体核酸检测的6091 例住院患儿的临床资料，年龄22 天～15岁。患儿入院后，同时采集血清样本和咽拭子（或痰标本）各1 份及时做肺炎支原体抗体IgM 和核酸检测。

1.2 方法（1）仪器与试剂：抗肺炎支原体抗体IgM检测试剂盒购自欧盟医学诊断有限公司，肺炎支原体核酸检测试剂盒购自广州中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500 型实时荧光定量PCR 基因扩增仪（美国ABI 公司），HydroFlex 洗板机和Sunrise 酶标仪（Tecan公司）。（2）ELISA 检测：采用ELISA 原理，微孔板条上包被的肺炎支原体抗原可与稀释样本中的IgM 结合，加入酶标抗人IgM 抗体温育后加底物显色。具体检测方法严格根据使用说明书进行，每板设阴性对照3 孔，阳性对照2 孔和空白对照1 孔。设定酶标仪波长于450nm处，用空白孔调零点后测定各孔吸光度（A 值），按照说明书上标定的范围和标准判断阳性和阴性。（3）RTPCR 检测：取处理后样品、阴性对照、阳性对照和空白对照的上清液2 μl 加入试剂盒反应液中做MP 核酸定量检测。RT-PCR 反应循环条件：93℃ 2 min，1 个循环；93℃ 45 s，55℃ 60 s，10 个循环；93℃ 30 s，55℃45 s，30 个循环，操作严格按照试剂盒产品使用说明书。记录阳性结果的Ct 值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件。计数资料用%表示，两组间比较采用χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MP检测方法比较 MP抗体IgM阳性或MP核酸阳性共846 例，阳性率13.89%，其中562 例MP 抗体IgM检测阳性（9.23%），383 例MP 核酸检测阳性（6.29%），MP 抗体IgM 检测阳性率高于MP 核酸，二者差异有统计学意义（χ2=134.82，P=0.00）（见表1）。两种方法阳性不符合率为12.26%。

表1 MP抗体与核酸方法检测结果比较

2.2 不同年龄与季节MP 阳性分布 两种方法在不同年龄组均检出MP 阳性，阳性结果主要集中在1～3 岁（51.42%），其次是4～6 岁（22.70%），差异有统计学意义（见表2）。不同季节均检出MP 阳性，其中11-12 月份阳性率最高，其次是1 月份，其它季节散发（见图1）。

表2 不同年龄组两种不同检测方法MP阳性的检出情况

图1 不同季节MP阳性分布情况（例数）

3 讨论

MP 近年来发病率逐年增多，但由于其早期临床表现多样、病情轻重不一，反复，影像学检查无显著特征等，使得MP 鉴别诊断较为困难。此外MP 无细胞壁，导致作用于细胞壁的常见抗生素对MP 不敏感，因此对MP 感染较为特异、快速的实验室检测显得十分重要。MPP 发病率在不同国家、不同地区差异较大［4］。本资料结果显示，两种方法结合检测总阳性率为13.89%。MPP 好发于学龄期儿童，近年来<5 岁儿童MPP 的报道有所增加［5］，本资料结果显示，MP 感染在1～6 岁儿童高发。MP 感染全年散发，不同地区的流行季节有所差异，北京MP 检出阳性率在夏秋季及秋冬季较高［6］，南京以夏秋季高发［1］，而本资料结果显示冬季高发。

人体感染MP 后能产生特异性IgM 类抗体，且通常在感染后第1 周出现，在第3 周达到最高滴度［7］，而MP 感染的潜伏期为2～3 周。儿童患者的特殊性导致其在临床上较难采集双份血清，本资料仅纳入单份血清结果，其中284 例患儿核酸阳性而抗体IgM 阴性，不排除检测时患儿处于感染早期甚至潜伏期而抗体IgM 未产生的可能。

PCR 法检测MP 具有较高的敏感性和特异性，且不受患者年龄、病程进展、抗体产生的时间和患者免疫功能等因素的影响［8］，也可了解患者体内MP 感染及自我复制的情况，对早期检测MP 感染具有重要意义。但PCR 法容易受操作技术影响，也不能区分无症状携带或急性感染。本资料中463 例抗体IgM 阳性而核酸阴性，不排除由于儿童无法配合导致取样不准确造成假阴性的可能。而抗体IgM 阳性率较高，也可能存在部分抗肺炎衣原体抗体IgM、抗嗜肺军团菌抗体IgM 等的交叉反应。本资料中，两种方法阳性不符合率为12.26%。对于检测结果不相符的患儿，核酸阳性可以作为MP 感染的预判，而抗体IgM 阳性的标本应该根据临床症状体征、影像学检查、用药情况等作进一步判断。

综上所述，两种方法在临床诊断中相互弥补，建议同时选择两种方法以提高临床检出率。