金莲花总黄酮对脂多糖诱导大鼠心脏炎症反应的抑制作用

郑平 王玲 童芬美*

内毒素血症或脓毒血症患者可出现全身炎症反应综合征，导致多器官功能衰竭和早期心肌功能障碍［1-2］。约45%的脓毒血症患者心肌损伤持续发展，心功能障碍预后不良［3-4］。研究发现，在脂多糖（LPS）诱导的脓毒症小鼠模型中也观察到心功能障碍［5-6］。LPS 位于革兰阴性菌细胞壁最外层，可明显诱导心肌细胞损伤，影响心脏功能［7］，且其心脏并发症与心脏细胞凋亡和促炎细胞因子过表达有关［8］。此外，研究也报道了LPS诱导的促炎细胞因子激活与核因子κB（NF-κB）刺激多种促炎细胞因子过表达有关，从而影响心肌功能［9］。相反，NF-κB 失活被证明可以减轻LPS 诱导的心功能障碍［10-11］。金莲花具有清热解毒、抗菌消炎等功效。其黄酮类化合物为金莲花的主要活性成分，具有保护心脑血管及心肌缺血再灌注损伤的作用［12］。本研究在建立LPS 诱导大鼠心肌损伤的基础上，探讨金莲花总黄酮对大鼠心脏炎症反应的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD 大鼠24 只，体重（200±20）g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。随机分为4组，正常对照组（control组），脂多糖组（LPS组），金莲花总黄酮组（FTTF组）和金莲花总黄酮+脂多糖组（FTTF+LPS组）。FTTF组和FTTF+LPS组大鼠灌胃给予金莲花总黄酮，100 mg/kg［12］，1 周，control组和LPS组给与等量纯水。第7 天灌胃后2 h LPS组和FTTF+LPS组大鼠腹腔注射脂多糖（10 mg/kg），control和FTTF组给予同等体积生理盐水。

1.2 主要试剂与仪器 金莲花总黄酮由西安瑞盈生物科技有限公司提取（批号：20160414，纯度：98%）购自于西安瑞盈生物科技有限公司（20160414）。ELISA试剂盒购自于武汉华美生物工程有限公司（IL-6：CSB-E04640R，IL-1β：CSB-E11987r，TNF-α：CSBE11987r）；CD68 抗体购自于武汉塞维尔生物有限公司（货号：GB11067），NF-κB 及磷酸化NF-κB 抗体（货号：mAb #8242，mAb #3033），STAT3 以及磷酸化STAT3抗体（货号：mAb #9139，mAb #9145）抗体均购自于CST 公司。台式高速冷冻离心机（中国湘仪离心机仪器有限公司，TGL-16M），电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 HE 染色观察心脏病理学改变 造模结束后，各组大鼠用25%乌拉坦5 mL/kg 腹腔注射麻醉，分离大鼠心脏左心室置于4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、包埋、切片，进行HE 染色，光镜下观察组织病理学变化。

1.4 免疫组化检测心肌CD68 表达水平 心肌组织于4%多聚甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、切片。按照流程脱蜡至水，抗原修复，加入一抗过夜，加入二抗（37℃，1 h），DAB 染色后，在光学显微镜下观察心肌组织表达水平。

1.5 ELISA 检测炎症因子表达 心肌组织匀浆液于4℃ 3000 r/min 离心10 min 取上清液，采用ELISA 方法测定IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

1.6 Western blot 检测NF-κB 和STAT3 及其磷酸化水平 心脏组织按100 mg/ml 加入蛋白裂解液，超声破碎后，离心（12,000 r/min，15 min，4℃）取上清，测定蛋白浓度后，变性，-80℃保存待用。制备分离胶和浓缩胶，每孔蛋白上样量为50 μg 蛋白，电泳（80 V，40 min；160 V，90 min）。电泳结束后进行湿转（300 mA，90 min），5%脱脂牛奶封闭，加入一抗（1 ∶1000）4 ℃孵育过夜；TBST 清洗3 次，加入相应二抗（1 ∶5000）孵育2 h 后，ECL 发光显色。采用Image J 软件分析灰度值，以p-NF-κB/NF-κB 以及p-STAT3/STAT3 比值表示磷酸化水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以（）表示，多组比较行单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较方差齐者采用Turkey 检验，方差不齐采用Dunnett'st检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金莲花总黄酮对LPS 大鼠心肌炎症反应的影响 与Control组比较，LPS组大鼠心肌组织排列紊乱，可见炎症细胞浸润。给予金莲花总黄酮干预能明显改善心肌细胞的病理改变，炎症细胞浸润减轻。见图1。

图1 各组大鼠心脏组织病理学形态（HE ×400）

2.2 金莲花总黄酮对LPS 大鼠心肌CD68 表达的影响 与Control组比较，LPS组大鼠心肌组织CD68 表达明显增多（P<0.001），给予金莲花总黄酮干预能降低心肌组织CD68 表达水平（P<0.05）。见图2。

图2 CD68在各组大鼠心肌组织的表达（×400）

2.3 金莲花总黄酮对LPS 大鼠心肌炎症因子水平的影响 与Control组比较，LPS组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明显增多（P<0.001），金莲花总黄酮干预能明显降低心肌组织中IL-1β、IL-6、TNF-α水平（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（）

表1 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较（）

注：与Control组比较，*P<0.001；与LPS组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.4 金莲花总黄酮对LPS 大鼠心肌NF-κB 和STAT3及其磷酸化水平的影响 与Control组比较，LPS组大鼠心肌组织中p-NF-κB/NF-κB 及p-STAT3/STAT3比值均明显上调（P<0.001，P<0.01），金莲花总黄酮干预能明显降低心肌组织NF-κB 及STAT3 磷酸化水平（P<0.01，P<0.05）。见图3。

图3 各组大鼠NF-κB，STAT3表达及其磷酸化水平比较

3 讨论

金莲花是一种用于治疗炎症相关疾病的中药，如肠道感染、扁桃体炎、咽炎等［13］。金莲花口服液在抗炎和清热解毒方面起到较好的效果［14］。金莲花的主要化学成分中总黄酮约占金莲花干重的16%，被认为是金莲花中最主要活性物质，药理学研究也证实金莲花抗菌抗炎的主要活性成分是黄酮类化合物［15］。本研究发现金莲花总黄酮可明显改善PLS 诱导的心肌炎症反应，保护心肌受损。

大量证据表明IL-6 和TNF-α 等促炎因子的上调是心室重构的直接因素，IL-6-STAT3 信号通路的激活，致使进一步心室重构的发展。IL-1 是多种细胞感染产生的免疫应答因子，无论在体外实验还是体内实验［16］，TNF-α 和IL-1 均能够诱导细胞凋亡，继而放大炎症反应。本研究结果提示，金莲花总黄酮干预能够降低IL-6、IL-1 及TNF-α 表达，减轻LPS 诱导的大鼠心肌炎症反应。

NF-κB 在炎症反应中起到关键性作用，是IL-6、IL-1β以及TNF-α等炎症因子主要的调节剂。NF-κB信号通路是心肌肥厚发生的主要途径之一［16］，研究证明NF-κB 信号通路的激活能介导IH 诱导的心室重构［17］。NF-κB 磷酸化激活后入核，启动转录激活蛋白3（STAT3）的磷酸化在促进心肌细胞重新进入细胞周期中起重要作用［18］。研究表明，IL-6 主要通过激活JAK/ STAT3 信号通路促进心肌细胞增殖［19］。本研究结果显示，金莲花总黄酮的干预下调LPS 诱导大鼠心肌NF-κB 和STAT3 的磷酸化水平。

综上所述，金莲花总黄酮可以通过下调LPS 诱导大鼠心肌NF-κB 和STAT3 磷酸化水平，降低IL-6、IL-1β 以及TNF-α 等炎症因子水平，从而改善大鼠心肌炎症损伤，为内毒素血症的中医药防治提供新的思路与实验依据。