基于网络药理学脑血疏口服液对脑出血继发脑损伤影响的作用机制研究

刘若凡，黄 幸，仪 凡，李晶娅，孔静敏，张根明

(1. 北京中医药大学第一临床医学院，北京 100029；2. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)指非创伤性脑内血管破裂导致脑实质出血，是发病率第二位的卒中亚型，具有高死亡率、高致残率的特点[1]。目前脑出血治疗以控制血压、减轻脑水肿等内科治疗为主，对于符合手术适应证者可采取外科治疗[2]。脑血疏口服液由黄芪、水蛭、牛膝、石菖蒲、大黄、牡丹皮、川芎组成，具有益气活血化瘀的功效，适用于气虚血瘀所致中风，包括出血性中风急性期和恢复早期。部分研究证实脑血疏口服液具有减轻脑水肿、神经保护等作用[3-4]，但具体药效物质基础及分子水平作用机制仍未完全阐明。基于系统生物学等方法提出的网络药理学为探索中药复方的物质基础与作用机制提供了新的研究模式[5]，本研究拟采用网络药理学方法探索脑血疏口服液改善脑出血继发脑损伤的药效成分、作用靶点与信号通路，为下一步通过实验研究揭示其疗效的具体作用机制提供研究基础。

1 资料与方法

1.1药物有效化合物收集与筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台 (TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php) 收集脑血疏口服液中黄芪、石菖蒲、牛膝、牡丹皮、大黄、川芎的化合物并通过文献检索收集水蛭的化合物，查找以上药物的CAS号或InChIKey信息，利用Pubchem数据库 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 检索以上药物收集的所有化合物结构，剔除无化学结构的成分，将化合物信息以2D结构保存为SDF格式，输入Swiss ADME数据库 (http://www.swissadme.ch/index.php) 中以药代动力学中胃肠吸收高、类药性(drug likeness，DL)中通过≥2个过滤器为条件初步筛选有效化合物。

1.2药物作用靶点预测 将初步筛选后所得的化合物输入SwissTargetPrediction数据库 (http://www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测，物种设定为智人，剔除无靶点的化合物，以可能性>30%为筛选条件得到预测靶点[6]。

1.3脑出血靶点收集与共同靶点筛选 在GeneCards数据库 (https://www.genecards.org/) 中以“intracerebral hemorrhage”为关键词检索脑出血相关的作用靶点。利用bioinformatics Gent工具 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) 取有效化合物与疾病靶点交集，获得二者共同靶点并绘制韦恩图。

1.4化合物-靶点网络与蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建 利用Cytoscape3.7.2构建有效化合物-靶点相互作用网络和脑出血药效成分-靶点相互作用网络。将上述方法所得共同靶点导入String数据库[7](https://string-db.org/)，选择Multiple Proteins，物种设定为“Homo sapiens”，最低要求互动分数为中度信度(0.4)，得到蛋白相互作用信息，结果保存为TSV格式导入Cytoscape3.7.2构建PPI网络，利用Network analyzer功能进行拓扑分析。

1.5靶点通路富集分析 通过Metascape数据库[8](http://www.metascape.org/)对共同靶点进行基因本体(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。导入共同靶点，物种设定为智人，设定Min Overlap为3，P值<0.01，Min Enrichment为1.5，分别导出生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)进行GO和KEGG富集分析。采用线上绘图工具bioinformatics(http://www.bioinformatics.com.cn/)将所得结果可视化，将KEGG通路相关信息导入Cytoscape软件构建共同靶点-通路网络。

2 结 果

2.1脑血疏口服液有效化合物及靶点预测 利用Swiss ADME数据库按照条件筛选出有效的候选化合物水蛭33个，黄芪33个，石菖蒲51个，牛膝32个，牡丹皮21个，大黄28个，川芎73个，剔除重复成分后得到235个有效化合物。其中水蛭素具有抗凝、抗炎等药理作用[9]，小檗碱具有抗血小板聚集、抗氧化、抗炎等药理作用，黄连碱具有抗炎等药理作用[10]，虽不符合筛选条件，但具有广泛的药理活性，因此也作为候选化合物。利用SwissTargetPrediction数据库预测靶点，得到有效化合物靶点川芎40个，大黄66个，黄芪123个，牡丹皮107个，牛膝114个，石菖蒲116个，水蛭45个，合并去重复值后共得到229个单一预测靶点。

2.2有效化合物-预测靶点网络构建 利用Cytoscape3.7.2建立脑血疏口服液有效化合物-预测靶点之间的相互作用网络，包含303个节点，1275条边，通过Network analyze功能对网络进行拓扑属性分析。网络中每个化合物平均与19个靶点相互作用，每个靶点平均与5.2个化合物相互作用。Degree值前10的靶点为CA2、CA1、CA7、CA12、CA9、CA14、CA4、CA6、CA5A、AKR1B1，对应Degree值为352，273，50，45，40，28，28，28，26，23。

2.3共同靶点收集、药效化合物-共同靶点网络与PPI网络构建 经GeneCards数据库收集得到1062个脑出血相关靶点，与脑血疏口服液的229个预测靶点取交集后得到61个共同靶点(见图1)。共有38个药效化合物与共同靶点有相互作用，利用Cytoscape 3.7.2构建药物-药效化合物-靶点相互作用网络(见图2)，包含106个节点，199条变。网络中每个化合物平均与5.2个靶点相互作用，Degree值大于平均值的8个有效化合物为槲皮素、山柰酚、芹菜素、棕榈酸、咖啡酸、大豆甙元、白皮杉醇、水蛭素，对应Degree值为29，27，16，8，7，7，6，6。将共同靶点信息导入String数据库，利用Cytoscape3.7.2构建PPI网络(见图3)，剔除孤立靶点FUT7，网络中包含60个节点，399条边。平均Degree值为13.3，Degree值大于平均值的21个靶点为AKT1、SRC、TNF、EGFR、PTGS2、APP、MMP9、MMP2、KDR、PIK3CA、PPARG、REN、ESR1、F2、MPO、IL2、AGTR1、IGF1R、NR3C1、ACHE、ABCB1，可能是脑血疏口服液减轻脑出血继发脑损伤所作用的关键靶点。

Drug为脑血疏口服液有效化合物靶点；Disease为脑出血靶点图1 脑血疏口服液与脑出血相关靶点韦恩图

菱形代表药物与疾病的共同靶点；椭圆形代表药效化合物图2 脑血疏口服液治疗脑出血继发脑损伤药物-药效化合物-靶点相互作用网络

图3 脑血疏口服液治疗脑出血继发脑损伤药效靶点PPI网络

2.4GO及KEGG靶点通路富集分析

2.4.1GO富集分析 利用Metascape数据库对61个靶点进行GO富集分析，得到1 163个BP条目、70个CC条目、90个MF条目(P均<0.01，错误发生率<0.05)，根据-Log10(q-value)排序分别对前20个条目可视化(见图4)。在BP中靶点主要涉及氮化合物的细胞应答、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-Akt)信号转导、炎症反应的调节、循环系统过程、化学突触传递、环状有机化合物的细胞应答等。在CC中靶点主要涉及膜筏、突触后、核包膜管腔、受体复合物等。在MF中靶点主要涉及类固醇激素受体活性、神经递质受体活性、蛋白质酪氨酸激酶活性、长链脂肪酸结合、外源性跨膜转运ATP酶活性、丝氨酸水解酶活性、G蛋白耦联的腺苷受体活性、一氧化氮合酶调节剂活性、血红素结合、肽结合等。

图4 脑血疏口服液药效靶点GO富集分析

2.4.2KEGG通路富集分析 利用Metascape数据库对61个靶点进行KEGG通路富集分析得到100条(P<0.01，错误发生率<0.05)信号通路，根据-Log10(q-value)排序选取前20个条目绘制气泡图(见图5)。为进一步揭示其作用机制，构建共同靶点-KEGG通路网络图(见图6)，共同靶点参与的关键通路中Degree值前5为癌症途径(Pathways in cancer)、神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、癌症蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、PI3K-Akt信号通路、内分泌抵抗(Endocrine resistance)信号通路。其中癌症途径涉及靶点有AGTR1、AKT1、EGFR、IGF1R、ITGB1、MMP1、MMP2、MMP9、NOS2、PIK3CA、PPARD、PPARG、PTGS2、PTK2、EGLN1，癌症蛋白聚糖通路涉及靶点有ADORA1、ADORA2A、ADORA3、AGTR1、AGTR2、DRD1、DRD4、F2、GRIA2、NR3C1、HTR1A、HTR2A、OPRM1，内分泌抵抗通路涉及靶点有AKT1、EGFR、ESR1、MMP2、MMP9、OPRM1、PIK3CA、SRC。

图5 KEGG通路富集分析气泡图

3 讨 论

脑出血的损伤机制涉及复杂的病理过程，局部血肿的肿块效应和机械压迫可导致原发性脑损伤，血肿周围脑组织水肿、炎症反应以及血肿代谢溶解引起的毒性作用可引起继发性脑损伤，导致神经元坏死及神经功能受损[11]。脑出血属于中医的出血性中风，该病多在内伤积损的基础上又因情志失调或劳逸失和等诱因触发，脏腑阴阳失调，气血逆乱，瘀血阻滞，脉道不利，血溢脉外，压迫脑髓是其发病的基本病机。发病后其病理过程的演变与痰、瘀、水、虚等病理因素密切相关，发病后脏腑功能失调，瘀血阻滞脉络，气化生失司，可致气机不畅，另一方面，“血不利则为水”，瘀血阻于脉络致水液代谢失常，继则痰浊内生，瘀、痰、水相互胶结，进一步影响脏腑功能恢复，因此气虚血瘀是贯穿疾病全程的病理基础[12-13]，故而益气活血化瘀是针对脑出血这一病理基础的重要治法之一。脑血疏口服液以“气为血之帅，血为气之母”作为理论基础而研制，其中黄芪既可益气又有利水之效，水蛭破血逐瘀，牛膝、川芎、大黄、牡丹皮均具有活血化瘀之效，大黄、牡丹皮兼有清热凉血之功，川芎兼可行气，石菖蒲开窍豁痰醒神，与脑出血急性期及恢复早期的病机及病理基础相互对应。前期已有实验研究表明脑血疏口服液可促进血肿吸收[14]，降低血脑屏障通透性并减轻脑水肿[15]，可改善神经功能缺损[4]，但该药治疗脑出血并减轻继发脑损伤的作用机制在分子通路方面研究较少。

本研究通过脑血疏口服液有效化合物-靶点-疾病网络分析，发现脑血疏口服液包含235个有效化合物，其中与治疗脑出血减轻脑损伤相关靶点密切关联的成分有38个，水蛭素、槲皮素、山柰酚、芹菜素、大豆甙元、白皮杉醇等为起到主要药效作用的化合物。有研究证明水蛭素通过抑制纤维蛋白原向纤维蛋白转化减轻脑出血后的炎症反应，可通过调控JAK2等信号通路抑制血管内皮细胞凋亡，在脑出血早期应用可减轻脑损伤[16-18]。槲皮素是一种黄酮醇类化合物，具有神经保护、抗氧化等作用，可以通过下调促炎细胞因子和趋化因子的表达以减轻炎症介导的神经元损伤[19]，并可与山柰酚协同作用通过激活Nrf2-ARE、TLR4/MyD88等途径减少细胞损伤、保护血脑屏障[20-21]，此外槲皮素通过调节血管顺应性、周围血管阻力等途径起到降压作用[22]。芹菜素是一种黄酮类化合物，可以通过抑制TLR4介导的炎症反应及上调血脑屏障紧密连接蛋白的表达而减少神经细胞凋亡[23]，而大豆甙元也具有降压及神经保护作用[24-26]。白皮杉醇是一种多酚化合物，具有抗炎等作用，并可通过调控JNK通路减少脑出血后神经细胞凋亡[27]。这进一步验证上述化合物是脑血疏口服液治疗脑出血并减轻继发脑损伤所具有的药效作用物质基础。

矩形代表共同靶点；椭圆形代表KEGG信号通路图6 脑血疏口服液与脑出血共同靶点-KEGG通路网络

有效化合物的PPI网络结果表明，脑血疏口服液减轻脑出血继发脑损伤时发挥作用的61个靶点中AKT1、SRC、TNF、EGFR、PTGS2、APP、MMP9、MMP2、KDR、PIK3CA是前10个关键靶点。其中如MMP9、MMP2属于基质金属蛋白酶，可在脑出血急性期参与神经炎症、血脑屏障渗漏等病理过程，并导致神经血管破坏和脑实质损害，后期则参与神经血管生成、组织重塑等病理过程促进神经功能恢复[28]，而PTGS2也可使环氧合酶-2在神经元中高度表达导致继发性脑损伤[29]。KDR是血管内皮生长因子受体，在调节血管生成及通透性中起到重要作用[30-31]，EGFR在脑出血后表达水平增高，并通过诱导星形胶质细胞活化增殖，对神经元产生毒性作用引起继发脑损伤[32-33]。提示脑血疏口服液通过上述多个靶点针对脑出血后的病理过程进行干预。

通过GO和KEGG富集分析发现，脑血疏口服液通过多条信号通路发挥治疗作用，涉及多个生物过程与分子功能及多种细胞组分。其中如神经活性配体-受体相互作用通路与神经功能直接相关，当神经活性配体-受体相互作用通路中的基因受到干扰后可导致记忆功能下降[34]。而癌症蛋白聚糖通路中涉及的ADORA1、ADORA2A、ADORA3等基因与脑出血后继发脑损伤密切相关，可通过下调基因表达抑制神经细胞凋亡[35]。癌症途径、内分泌抵抗通路、PI3K-Akt信号通路均涉及AKT1、PIK3CA、MMP2、MMP9等基因，PI3K作为一种蛋白酪氨酸激酶，激活的PI3K磷酸化激活Akt蛋白以抑制神经元凋亡并调控血管生成基因表达，参与保护神经功能[36]。以上均提示脑血疏口服液可能通过多条通路及多个作用靶点起到神经保护作用，继而减轻血肿代谢对脑组织的进一步损伤。

综上所述，本研究通过网络药理学分析发现脑血疏口服液中存在水蛭素、槲皮素、山柰酚、芹菜素、大豆甙元、白皮杉醇等多种有效化合物，可能通过AKT1、SRC、TNF、EGFR等靶点及抑制神经细胞凋亡、调控炎症反应及调节血管生成等过程减轻继发脑损伤，具有多靶点、多通路的特点，为深入探索脑血疏口服液减轻脑出血后继发脑损伤的作用机制的实验研究提供依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。