右美托咪定对老年结直肠癌患者术后认知功能及血浆miR- 206、BDNF水平的影响

陈小刚，汪正伟

(重庆两江新区第一人民医院 麻醉科，重庆 401147)

术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction，POCD)被认为与全身性炎症、神经细胞凋亡以及神经受损有关，在行结直肠癌手术的老年患者中发生率较高[1]。脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是神经元发育和记忆加工的关键因子，Wang等[2]在POCD大鼠海马中观察到给予右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)后缓解了大鼠相关的认知功能障碍和炎症改变，并上调脑组织BDNF的表达，进而发挥一定的神经元保护作用。目前有研究发现miR- 206与BDNF的表达相关[3- 4]，但是尚缺乏临床数据支持。本实验拟研究DEX对老年结直肠癌患者术后认知功能及血浆微小RNA- 206(microRNA- 206,miR- 206)、BDNF水平的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 一般资料 招募2018年1月至2019年12月期间在我院计划行全身麻醉腹腔镜下结直肠癌根治性切除术、年龄60～80岁的患者160例，按照随机数字表法将患者分为研究组和对照组两组各80例。研究组男51例，女29例，年龄60～80岁，平均(68.64±6.37)岁，病程(0.71±0.26)年；对照组男44例，女36例，年龄60～80岁，平均(69.31±6.58)岁，病程(0.68±0.21)年。两组年龄、性别、病程具有可比性(P>0.05)。本研究属于前瞻性、随机、对照研究，已经获得我院伦理委员会批准，且所有患者均签署知情同意书后方可入组。

1.1.2 纳入标准 (1) 年龄>60岁；(2) 美国麻醉医师协会(American Society of Anesthesiologists，ASA)病情分级Ⅰ～Ⅲ级；(3) 术前简易智力状态检查量表(mini- mental state examination，MMSE)评分≥23分；(4) 无沟通障碍。

1.1.3 排除标准 (1) 合并中枢神经系统损伤、心血管或呼吸系统疾病、肝肾功能障碍等；(2) 长期服用镇静剂、阿片类药物、镇痛药或抗抑郁药物者；(3) 有酗酒、吸烟或药物依赖史；(4) 麻醉前心动过缓(心率<60次·min-1)；(5) 对试验中所用药物过敏或有禁忌证。

1.2 手术麻醉处理及患者生命体征监测

为了消除手术技巧的可能影响，所有手术都由同一个手术组完成。所有手术均在全麻下进行。为保持双盲原则，麻醉准备和施行麻醉的麻醉医师在紧急情况发生前不参与管理或评估。患者术前常规禁饮禁食和行其他术前准备，根据疾病的位置、程度和分期进行标准的腹腔镜手术。用0.04 mg·kg-1咪达唑仑[规格为1 ml·(5 mg)-1，生产批号20171210，江苏恩华药业股份有限公司生产]、0.5 μg·kg-1舒芬太尼[规格为2 ml·(100 μg)-1，生产批号81A07207，宜昌人福药业有限责任公司生产]、0.3 mg·kg-1依托咪酯[规格为10 ml·(20 mg)-1，生产批号20180102，江苏恒瑞医药股份有限公司生产]和0.6 mg·kg-1罗库溴铵[规格为2.5 ml·(25 mg)-1，生产批号20180215A，浙江仙琚制药股份有限公司生产]诱导麻醉。瑞芬太尼(规格为每针按C20H28N2O5计1 mg，生产批号80A07251，宜昌人福药业有限责任公司生产)0.2～0.3 g·(kg·min)-1和丙泊酚[规格为10 ml·(0.1 g)-1，生产批号20180201，四川国瑞药业有限责任公司生产]0.1～0.15 mg·(kg·min)-1维持麻醉，必要时采用顺式阿曲库铵(规格为每针10 mg，生产批号181119AK，江苏恒瑞医药股份有限公司生产)肌肉松弛。研究组患者麻醉前10 min给予DEX[规格为2 ml·(200 μg)-1，生产批号171021BP，江苏恒瑞医药股份有限公司生产]1 mg·kg-1，术中给予DEX 0.3 mg·(kg·min)-1(10 min后由医生决定调整每例患者的输液速度)至手术结束前30 min。对照组患者术中给予等量生理盐水代替DEX。两组患者术中予心电图(ECG)、无创血压、心率脉搏血氧饱和度(SpO2)监测。前额放置Narcotrend麻醉深度监测仪(Narcotrend- Compact，德国汉诺威医科大学生产)，以记录手术期间的Narcotrend值。麻醉指数保持在D1～E之间。术中静脉输注乳酸钠林格注射液(规格为每瓶500 ml，生产批号D17100404- 1，四川科伦药业股份有限公司生产)和羟乙基淀粉(每500 ml含30 g羟乙基淀粉，生产批号81M1642，北京益民药业有限公司生产)，间歇性动脉血中含氧量分析，血红蛋白<100 g·L-1或血细胞比容<0.3时输注红细胞悬液或冷冻鲜血浆。

1.3 观察内容和指标检测

1.3.1 基线资料 收集所有患者基线资料，包括年龄、性别、体质指数(BMI)、血压、ASA病情分级等。

1.3.2 血浆miR- 206水平检测 术前及术后1、3、7 d使用抗凝采血管采取清晨空腹外周静脉血5 ml，3 500 r·min-1离心10 min，获取血浆于-80 ℃保存待测。采用miRNeasy RNA分离试剂盒(Qiagen公司)按说明书提取血浆总miRNA。通过纳米滴吸收光度法检测RNA质量，仅将A260/280>2.0的RNA片段用于后续反应。逆转录使用miScript Ⅱ RT试剂盒(德国Qiagen公司)进行。此外，使用预先设计的针对靶向miR- 206的混合引物和Qiagen miScript PreAMP PCR试剂盒进行12个周期的预扩增，选择小分子U6作为内源性参考基因。在7900 HT 快速实时PCR系统(美国Thermo Fisher scientific公司)上进行PCR扩增，以逆转录得到的cDNA为模板，采用Qiagen miScript SYBR Green PCR试剂盒进行扩增反应。扩增条件为：94 ℃ 10 min；94 ℃ 5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。用2-ΔΔCT公式对表达数据进行分析，用参考基因U6 mRNA对目标特异性扩增效率结果进行归一化处理。每个样本平均实验3次。miR- 206引物序列：正向5′- CCGAGGCCACATGCTTCTTTA- 3′，反向5′- TTGCCGAAACCACACACTTC- 3′；U6 mRNA引物序列：正向5′- CGCTTCGGCAGCACATATAC- 3′，反向5′- CAGGGCCATGCTAATCTT- 3′。

1.3.3 血浆BDNF水平检测 在术前和术后1、3、7 d时，使用EDTA抗凝管各采取清晨空腹外周静脉血2 ml，3 500 r·min-1离心10 min，获取血浆于-80 ℃保存待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)，应用BDNF ELISA试剂盒(美国R&D公司)测定BDNF水平；所有血浆样本用人BDNF免疫分析法进行双重分析，每个微量滴定板连续测定一个内部对照样本。样本的分析间变异系数为11.2%，分析内变异系数为6.3%。

1.3.4 术后认知功能测试 神经心理测试由实验前已经接受专业培训的研究人员进行。大部分测试都由同一个核心小组的研究人员完成。在术前及术后3、7 d 时采用MMSE评价认知功能，内容包括时间定向力、地点定向力、即刻记忆、注意力及计算力、延迟记忆、语言、视空间。根据Rasmussen等[5]的建议，用术后评分减去术前评分计算可靠性变化指数(reliable change index，RCI)，当RCI至少在2次测验中<-1.96 时定义为POCD。

1.3.5 不良反应发生情况 记录手术开始至术后3 d出现的不良反应，包括低血压、心率加快、心动过缓、呼吸抑制、恶心呕吐等。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 对照组与研究组患者术前资料和术中情况比较

对照组与研究组患者年龄、性别、BMI、病程、饮酒史、ASA病情分级、术前MMSE评分、合并疾病史、Duke分期及术中代血浆用量、尿量、出血量、麻醉持续时间、手术时间等比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 对照组与研究组患者术前资料和术中情况比较

2.2 对照组与研究组患者手术结局比较

研究组患者术后3 d和7 d时POCD的发生率低于对照组(P<0.05)，住院时间短于对照组(P<0.001)；研究组患者睁眼时间和拔管时间长于对照组(P<0.05和P=0.001)；两组患者术后不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 对照组与研究组患者手术结局比较

2.3 对照组与研究组患者手术前后血浆BDNF水平比较

重复测量设计的方差分析显示：(1) 患者不同时间点的血浆BDNF水平差异具有统计学意义(F=268.228，P<0.001)；(2) 对照组与研究组患者血浆BDNF水平比较差异具有统计学意义(F=58.868，P<0.001)；(3) 对照组与研究组患者血浆BDNF水平变化趋势比较差异具有统计学意义(F=30.265，P<0.001)。另外Post- hoc分析显示，术后1、3、7 d时，研究组患者血浆BDNF水平高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 对照组与研究组患者手术前后血浆BDNF水平比较

2.4 对照组与研究组患者手术前后血浆miR- 206相对表达量比较

重复测量设计的方差分析显示：(1) 患者不同时间点的血浆miR- 206相对表达量差异具有统计学意义(F=118.079，P<0.001)；(2) 对照组与研究组患者血浆miR- 206相对表达量差异具有统计学意义(F=374.532，P<0.001)；(3) 对照组与研究组患者血浆miR- 206相对表达量变化趋势差异具有统计学意义(F=44.805，P<0.001)；另外术后1、3、7 d时，研究组患者血浆miR- 206相对表达量低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 对照组与研究组患者手术前后血浆miR- 206相对表达量比较

2.5 POCD组与非POCD组患者手术前后血浆BDNF水平和miR- 206相对表达量变化比较

根据术后7 d时是否发生POCD，将160例手术患者分为POCD组(n=21)与非POCD组(n=139)，比较两组患者术前及术后1、3、7 d时的血浆BDNF水平和miR- 206相对表达量。重复测量设计的方差分析显示：(1) 患者不同时间点的血浆BDNF水平和miR- 206相对表达量差异均具有统计学意义(BDNF：F=225.860，P<0.001；miR- 206：F=1089.637，P<0.001)；(2) POCD组与非POCD组患者血浆BDNF水平及miR- 206相对表达量差异均具有统计学意义(BDNF：F=837.256，P<0.001；miR- 206：F=1 793.458，P<0.001)；(3) POCD组与非POCD组患者血浆BDNF水平及miR- 206相对表达量变化趋势差异均具有统计学意义(BDNF：F=165.430，P<0.001；miR- 206：F=572.819，P<0.001)。另外，与非POCD组相比，术后1、3、7 d时，POCD组患者血浆BDNF水平均较低，血浆miR- 206相对表达量均较高，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表5。

表5 POCD组与非POCD组患者手术前后血浆BDNF水平及miR- 206相对表达量比较

2.6 ROC曲线分析术后1 d时miR- 206相对表达量对POCD发生的预测价值

术后1 d时miR- 206相对表达量对患者术后3、7 d POCD的发生均有一定的预测价值，AUC分别为0.78(95%CI为0.67～0.84，P<0.001)、0.82(95%CI为0.71～0.89，P<0.001)。最佳阈值分别为4.15和4.10，灵敏度分别为84.5%和94.32%，特异度分别为64.98%和62.17%。见图1。

图1 术后1 d时血浆miR- 206相对表达量预测术后3、7 d POCD发生的ROC曲线 A.预测术后3 d POCD发生的ROC曲线； B.预测术后7 d POCD发生的ROC曲线

2.7 多因素Logistic回归分析影响POCD发生的危险因素

将术后7 d时POCD的发生作为因变量(POCD=1，非POCD=0)，将术前(年龄、性别、BMI、病程、饮酒史、ASA病情分级、术前MMSE评分、合并疾病史、Duke分期)、术中(代血浆用量、尿量、出血量、麻醉持续时间、手术时间)相关指标及术后1 d血浆miR- 206相对表达量纳入单因素Logistic回归模型，结果显示，术前MMSE评分、糖尿病史、DEX使用以及术后1 d时血浆miR- 206相对表达量与术后7 d时POCD的发生风险有关(P<0.05)；将上述变量纳入多因素Logistic回归方程，结果显示，患者术后3 d和7 d时POCD发生的危险因素为有糖尿病病史、DEX使用以及术后1 d时血浆miR- 206相对表达量>4.10(P<0.05)。见表6。

表6 术后7 d时POCD发生的Logistic回归分析

3 讨 论

目前共识认为老年人群POCD的发生率比60岁以下人群更高，而且POCD多与患者术后恢复不良、住院时间延长、住院费用和长期康复需求较高以及死亡风险大有关[6- 8]。本研究中，术前10 min和术中给予DEX可降低老年(≥60岁)结直肠癌患者在腹腔镜下根治手术后3 d和7 d内认知功能障碍的发生率。这与既往众多研究[9- 10]结论一致，作者推测这可能与DEX具有抗炎及改善术后疼痛作用有关。DEX是一种高效、高选择性的跨膜G蛋白偶联中枢α2受体激动剂，可减少中枢神经系统交感神经流出，除降低血压和心率外，还可提供镇静和镇痛作用，而不会引起呼吸抑制[11]。除此以外，DEX的阿片类作用是众所周知的。这些特性使其成为重症监护病房和围手术期患者镇静的合适选择。但本研究由于纳入的样本量偏少，研究组与对照组老年患者术后低血压、心率过缓、心动过速、呼吸抑制等不良反应发生率的差异未显示统计学意义。此外有体外研究认为，长期使用DEX可活化PI3K/AKT信号通路，进而促进结直肠癌肿瘤细胞的增殖和迁移等[12]，但是这一点尚没有临床证据支持。而且作为麻醉用药，DEX短时间内即可代谢，因此其对肿瘤细胞的影响几乎可以忽略不计。

POCD是一个多因素的疾病模型，虽其发病机制并不清晰，但临床普遍认为其是神经系统老化、麻醉、手术及术前病史等多种因素共同诱发的[13]。此外，很多基础研究发现，BDNF在POCD发生过程中可能涉及沉默信息调节因子1信号通路的激活、NF- κB信号通路的抑制等[14- 15]。本研究也发现POCD患者血浆BDNF浓度在术后7 d内的变化与非POCD患者间差异具有统计学意义，而且在术后1、3、7 d时，POCD组患者血浆BDNF水平均显著低于非POCD组患者，说明麻醉及手术过程诱导BDNF浓度增加可能是导致POCD发生的重要机制。BDNF是一类保护性的神经营养因子，广泛分布于中枢神经、周围神经及内分泌等系统，具有维持神经系统发育、促神经系统损伤修复等作用。LÜ等[16]通过使用新生大鼠的海马神经元细胞为模型，得出DEX可以通过上调BDNF的表达及N- 甲基- D- 天门冬胺酸受体磷酸化水平来实现神经保护作用的结论。同时Dong等[17]认为，DEX也可以通过减轻麻醉药物对BDNF的抑制作用进而提高BDNF水平。这些基础研究结论都很好地解释了本研究结果。但是需要强调的是，血浆中BDNF水平受到血脑屏障的影响较大，因此并不能完全反映其脑内水平；而且不同手术类型可能造成的血脑屏障损害不同，这将干扰血浆BDNF水平作为POCD外周血循环标志物的敏感性。但是与BDNF蛋白表达相关的miRNAs则不易受到血脑屏障的影响，而且在神经元损伤早期即可表现出变化，因此在本研究中，我们期望寻找比BDNF更敏感的miRNAs用于POCD的临床预测以及对POCD发生风险的评估。

BDNF转录本包含短非编码区(BDNF- sh，350nt)和长非编码区(BDNF- l，2891nt)。Xing等[18]证实，miR- 206对BDNF基因转录后翻译有一定的抑制作用。除了长度，3′UTR的二级结构也影响BDNF mRNA的稳定性，其中部分是通过修改转录本中miRNAs靶点的可接近性。BDNF- l包含了调节转录稳定性所必需的茎环结构，这提高了二级结构的稳定性。因此到目前为止，只发现少数miRNAs可与BDNF mRNA结合，并参与BDNF水平的生理和病理性调节，其中就包括miR- 206。在本实验中，我们首次通过临床研究证实，术后1 d血浆miR- 206相对表达量变化对POCD有一定的预测价值。在这里需要强调的是，肿瘤本身对血浆miR- 206水平也有一定的影响，但是术前POCD组和非POCD组患者血浆miR- 206水平无显著差异，而我们考察的是术后1 d时血浆miR- 206水平对POCD发生的影响，因此术后残余肿瘤对血浆miR- 206水平的影响几乎可以忽略。并且我们通过多因素Logistic回归分析，尽可能校正多种术前和手术过程中混杂因素后得出，术后1 d血浆miR- 206相对表达量依然是老年结直肠癌患者POCD发生的独立危险因素。

综上所述，对于接受全麻手术的老年结直肠癌患者，POCD的发生可能与术后血浆miR- 206相对表达量升高及BDNF水平降低有关，尤其是血浆miR- 206相对表达量升高是POCD发生的独立危险因素。而给予DEX，则可以明显提高患者术后7 d内血浆BDNF水平，降低血浆miR- 206相对表达量，这可能是降低POCD发生风险的分子机制之一。本研究从分子机制角度进一步证实了DEX对手术和麻醉引起的神经组织损伤有一定的保护作用，从而可为DEX的临床应用提供更可靠的实验证据支持。

声明：本文所有作者间不存在利益冲突。