猪HINT1基因多态性及其在肌肉组织中表达差异的分析

梁馨文，邢 璐，董世雄，徐士军，张 健，段梦琪，张 博，商 鹏*

（1.西藏农牧学院动物科学学院/西藏特色农牧资源研发省部共建协同创新中心，西藏林芝 860000；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100094）

肌肉是评定猪肉肉质性状的重要标志之一，也是猪维持正常运动和生理代谢过程中必不可少的组成部分[1]。动物的肌肉生长发育机制非常复杂，是受许多遗传基因以及信号通路等复杂网络调控的[2]。组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（histidine triad nucleotidebinding protein1，HINT1）基因是HIT蛋白超家族的成员之一[3-4]，属于组氨酸三聚体蛋白核苷酸转移酶和水解酶家族成员[5]，在原核生物和真核生物中广泛表达[6]。有研究报道，哺乳动物HINT1蛋白可作用于多种信号通路[7]，调控转录因子活性，调节细胞的分化、在促使细胞凋亡、抑制细胞增殖和肿瘤发生、发展中起到重要作用[8]。截至目前，多数研究报道围绕HINT1基因大多跟人类疾病相关，已有研究证实HINT1基因的突变会导致人类常染色体轴突神经病变伴神经肌强直[9]，这些患者会出现肌肉无力，肌肉萎缩等相关症状[10-11]，表明HINT1基因对肌肉生长性状和肌肉发育具有一定的影响。HINT1基因在猪肌肉生长上的研究还未见报道。

大约克猪是著名的瘦肉型猪种，具有生长速度快、饲料利用率高和瘦肉率高等特点[12]。藏猪是世界上少有的高原型畜种，也是我国特有的地方品种资源，其能适应恶劣的高寒气候，具有体型小、生长速度慢[13]和胴体瘦肉率低等特点[14]。藏猪是西藏开发特色产业和推广绿色食品的重要物种资源，围绕藏猪生长和肉质性状的研究显得越发重要，本试验主要探究HINT1基因在藏猪和大约克猪中的多态性以及在两猪种的背最长肌和腿肌组织中的表达水平，为进一步了解HINT1基因在猪肌肉组织中的调控作用奠定一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物材料

试验选择饲养于西藏林芝市西藏农牧学院教学实习牧场（海拔2 900 m左右）的藏猪（TP）和林芝市宇高生态农业开发有限公司的大约克猪（YY）作为试验对象。试验猪只均为去势公猪，随机挑选30日龄、90日龄及180日龄且各个日龄的生长情况相近的藏猪和大约克猪各8头进行屠宰，屠宰后30 min内采集背最长肌组织和腿肌组织，放入RNA保存液，待RNA保存液与样本充分接触后置于液氮中保存，迅速带回实验室，-80℃保存，用于总RNA提取。采集93份耳组织（藏猪48头，大约克猪45头），置于75%酒精中，-20℃保存用于DNA提取。

1.2 主要试剂

RNase free water、Fastking cDNA第一链合成试剂盒、2×Power Taq PCR Master Mix（Bioteke Gorporation）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green)、Trizol（Thermo fisher）、SYBR Green Mix等均来自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 DNA、RNA的提取及cDNA制备

采用苯酚-氯仿法从耳组织中提取基因组DNA，提取合格的DNA放于-20℃保存备用。

采用Trizol法提取RNA，用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA样品的浓度，配置1%的琼脂糖胶分别检测RNA和DNA的完整性，提取合格的RNA放于-80℃保存备用。

采用一步法cDNA反转录试剂盒对RNA进行反转录，所得cDNA置于-20℃保存备用。

1.4 引物设计及合成

从NCBI官网 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载HINT1基因的mRNA序列（登录号：NM_005661623），用于实时荧光定量PCR引物设计，以GAPDH（登录号：NM_001206359）作为内参基因，实时荧光定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行设计并合成，合成后用RNase-Free water溶解，于4℃保存，定量引物见表1。

表1 定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative analysis

1.5 DNA引物设计与合成

登录 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下载 HINT1 基因(登录号：NC_010444)DNA序列。使用Premier 5.0软件设计HINT1基因5'侧翼区的特异性引物，送至上海生物工程有限公司合成，合成后用RNase-Free water溶解，4℃保存，引物序列见表2。

表2 HINT1基因5'侧翼区引物序列Table 2 Primer sequence of HINT1 gene 5'lateral region

1.6 实时荧光定量PCR

以cDNA为模板，选用GAPDH为内参基因，每个样品设置3个重复，PCR反应体系20 μL:SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，RNase-free ddH2O 8 μL，cDNA 模板 1 μL。在实时荧光定量PCR仪（罗氏，Light Cycler96）进行扩增。

1.7 HINT1基因的SNPs位点筛选

采用Sanger测序法对藏猪和大约克猪HINT1基因的起始密码子上游3 000 bp区域左右进行单核苷酸多态性分析。以提取的藏猪和大约克猪DNA为模板，首先选取藏猪和大约克猪各10头，采用混池测序对HINT1基因分析，经Chromas Pro软件进行序列对比分析，筛选出具有有效突变意义的SNPs位点后，扩大样本进行单个个体测序，由上海生物工程股份有限公司进行测序，将所得测序结果进行基因型频率与基因频率统计。

1.8 统计分析

首先使用Excel整理实时荧光定量PCR的结果，采用2-ΔΔCt法计算HINT1基因的mRNA的相对表达量。利用SPSS 25.0软件对HINT1基因表达量进行显著性分析，利用Graphpad Prism8制备图表，软件以平均值±标准误表示。运用Excel计算各个突变位点的基因频率和基因型频率，使用卡方检验分析HINT1基因的基因型频率和基因频率的差异性。

2 结果与分析

2.1 RNA提取结果

所提取的组织RNA经琼脂糖凝胶电泳检测质量较好。由图1可知，28s和18s条带清晰，其OD值范围在1.8～2.2之间，无降解也未有蛋白质和DNA污染，无明显拖尾，满足了后续试验要求。

图1 RNA样品凝胶电泳检测结果Figure 1 Gel electrophoresis results of RNA samples

2.2 HINT1基因在肌肉组织中的mRNA表达

运用实时荧光定量PCR技术检测HINT1基因在藏猪和大约克猪背最长肌和腿肌组织中的表达水平，结果见图2。由图2A可知，HINT1基因在30日龄藏猪背最长肌组织中的mRNA表达量极显著高于大约克猪（P20.01）；90日龄藏猪和大约克猪表达差异不显著（P30.05）；180日龄藏猪背最长肌组织中的mRNA表达量显著高于大约克猪（P20.05）。由图2B可知，HINT1基因在30日龄和90日龄藏猪腿肌组织中的 mRNA表达量极显著高于大约克猪（P20.01），180日龄藏猪腿肌组织中的mRNA表达量显著高于大约克猪（P20.05）。

图2 藏猪大约克猪HINT1基因30、90和180 d在背最长肌、腿肌组织中mRNA表达量Figure 2 mRNA expression levels of HINT1 gene in longissimus dorsi muscle and leg muscle of Tibetan pigs at 30,90 and 180 days of age

2.3 HINT1基因的SNPs位点分析

利用Chromas Pro和SPSS18.0进行分析，HINT1基因共有5个突变位点，结果见图3分别为：A-2230G、C-2209T、A-2174G、T-2083C 和 A-2082G，经卡方检验，所存在的5个突变位点均符合哈迪-温伯格定律（P30.05）。基因型频率、基因频率及卡方检验结果见表3。

表3 HINT1基因多态性位点基因型频率和等位基因频率Table 3 HINT1 gene polymorphism loci genotype frequency and allele frequency

图3 HINT1基因SNPs位点测序峰图Figure 3 Sequencing peak of SNPs of HINT1 gene

3 讨论

肌肉发育是由营养、时间、饲养管理、基因等多种因素共同影响的[15]，其中基因作为影响其发育的内在因素受到育种工作者的高度关注。组氨酸三聚体蛋白超家族是一个具有核苷酸转移酶和水解酶活性的家族，HINT1蛋白是组氨酸三联体（HIT）家族的成员之一[16]，它是一类普遍存在于哺乳动物组织、在进化中高度保守、分布最为广泛的一种蛋白[17]。有研究证实，HINT1基因的缺失会促进小鼠胚胎成纤维细胞的生长[18]，肌肉组织是从中胚层细胞中分化而形成的，中胚层分化出两种不同类型的细胞，即成肌细胞和成纤维细胞，成纤维细胞的生长进一步影响肌肉组织发育。在陈莹等[1]的研究中表明了在不同阶段藏猪与大约克猪中背最长肌组织的表达有着显著差异，且根据猪的生长趋势以及前人的研究报道得知猪的快速生长阶段是2～6月龄[19]，所以本文分别选取了30日龄、90日龄、180日龄的藏猪和大约克猪作为试验对象。实时荧光定量PCR结果显示，藏猪HINT1基因在背最长肌和腿肌组织中的表达量均在30日龄时达到巅峰，随后在90日龄和180日龄呈现逐渐降低的趋势，并且在30日龄时藏猪的背最长肌和腿肌组织中的表达水平极显著高于大约克猪（P20.01）。在90日龄时藏猪的背最长肌组织中的表达量高于大约克猪，但差异不显著（P=0.284），但在腿肌组织中藏猪的表达水平极显著高于大约克猪（P20.01），这说明不同猪种的肌肉组织在不同生长时期的生长速度是不同的，而藏猪在刚出生时的肌肉生长速度明显低于大约克猪[20-21]，这可能是藏猪生长缓慢的原因之一，且90日龄和180日龄是猪肌肉发育的关键时期，藏猪和大约克猪分别在两组织上表达趋势一致，但在90日龄稍有差别，这可能与不同发育阶段不同肌纤维类型生长速度不一致有关[22]。180日龄时藏猪的背最长肌和腿肌组织中的表达水平显著高于大约克猪（P20.05）。结合李洁等[23]的研究表明HINT1基因与氨酰-tRNA合成酶具有相同的水解产物，而表达氨酰-tRNA合成酶的相关基因会导致腓骨肌萎缩[23]。推测HINT1基因在猪的肌肉生长发育过程中发挥负调控作用。

本研究在HINT1基因5'侧翼区起始密码子上游3 000 bp左右发现5个突变位点：A-2230G、C-2209T、A-2174G、T-2083C 和 A-2082G。上述单核苷酸多态性位点的基因型频率和基因频率在藏猪和大约克猪中存在极显著差异（P20.01），且符合哈迪温伯格定律，推测这5个SNPs位点多态性可能是受HINT1基因调控后的品种间性状导致。结合5个SNPs位点的多态性与实时荧光定量PCR结果，进一步证明了HINT1可能是影响猪肌肉生长的关键功能位点，这符合藏猪和大约克猪的品种特性。研究结果表明HINT1基因会抑制肌肉的生长发育，但是对于该基因具体分子调控机制还需要进一步讨论。

4 结论

综上所述，本研究采用RT-qPCR和Sanger测序法，从不同品种猪的两个肌肉组织着手，探究了HINT1基因5'侧翼区域的多态性及mRNA表达差异的分析，推测5'侧翼区SNPs的变化影响了HINT1基因的mRNA表达水平，且HINT1基因的表达与骨骼肌的生长发育呈负相关。本研究结果为进一步探索猪生长发育及分子辅助育种提供一定的新思路和理论依据。