茄子SmCOL5基因在花青素生物合成中的功能分析

胡艺伟,李大露,席浩淳,何永军,陈火英,刘 杨

(上海交通大学农业与生物学院,上海 200240)

花青素是一种天然的类黄酮水溶性色素,在自然界中广泛分布,目前已知有近30个科的被子植物中含有花青素[1]。花青素具有卓越的抗氧化性,其抗氧化机制是清除自由基,以避免过多的自由基对机体造成损害[2]。此外,花青素还具有抵御癌症、降低血糖等生理功能[3-4]。茄子是少有的紫色蔬菜,其果肉营养丰富,含有可溶性糖、脂肪、蛋白质、维生素及铁、磷等多种营养成分。茄子果皮中含有丰富的花青素,茄子中花青素的抗氧化性效果比常见蔬菜作物所含的花青素更佳[5],是人类补充天然花青素的优质来源。提高茄子果皮中的花青素含量,可有效提高茄子的营养价值和商品价值。

花青素生物合成途径网络由上游的调控基因和下游的结构基因构成,苯丙氨酸经过多步反应转化成稳定的花青素[6],该途径重要的结构基因包括查尔酮合成酶基因(C HS)和黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)等。已有研究证明,SmCHS基因和SmF3H基因在茄子花青素生物合成中具有促进作用[7]。目前对花青素生物合成途径上游调控基因的研究中,由MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白组合成的MBW复合体居多,也较为深入。MYB类转录因子分为多种类别,其中与花青素合成关系最为密切的是R2R3-MYB转录因子。研究表明,GmMYB042基因过表达的烟草植株中,总黄酮量显著升高,其类黄酮代谢途径中的多个结构基因的表达量增加[8]。在茄子中,SmMYB1转录因子可与花青素合成关键酶基因CHS和DFR的启动子结合,促进花青素合成;COP1是E3泛素连接酶组成的光形态建成基因,其被认为是一种分子开关,调控植物的光调控发育[9];SmCOL4蛋白和SmCOL5蛋白都是BBX转录因子。BBX转录因子属于锌指结构蛋白家族,在其氨基酸序列中,具有1—2个B-box基序[10],BBX转录因子参与植物的许多生理活动,如植物的光形态建成、成花过程、响应生物与非生物胁迫以及激素信号转导等。研究表明,水稻中的BBX蛋白OsCOL15可以通过上调OsGHD7基因或者下调OsR ID1基因的表达影响水稻开花[11];在苹果中,MdCOL11蛋白为光形态建成的正向调控因子,其过表达植株下胚轴显著短于野生型,并且花青素含量显著增多,说明部分BBX类基因也参与调控植物花青素的生物合成途径[12]。本研究通过亚细胞定位、酵母双杂交、酵母单杂交等方法,探究茄子中的目的基因SmCOL5与光调控和花青素合成相关基因的互作情况,以期为提高茄子花青素含量,选育优质茄子品种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为实验室保存的茄子种质资源‘蓝山禾线’和FGM。‘蓝山禾线’为光敏感型茄子,在正常光照条件下生长时,其果皮呈现紫色,在套袋遮光条件下生长则呈现白色。FGM为非光敏型茄子,在正常光照和套袋遮光条件下果皮均呈现紫色。试验中使用到的大肠杆菌DH5α由北京全式金生物技术有限公司提供;酿酒酵母AH109和根癌农杆菌GV3101由上海唯地生物技术公司提供。

1.2 SmCOL5基因的克隆及表达模式分析

首先对茄子的部分基因进行光响应表达模式分析,通过比较后选取SmCOL5基因作为研究对象。在茄子基因库网站(http:∕∕eggplant.kazusa.or.jp∕)中获取SmCOL5基因(Sme2.5_25 982.1_g00 001.1)的序列,使用软件Primer Premier 5设计引物SmCOL5-F、SmCOL5-R(表1),并委托生工生物工程(上海)公司合成引物。使用日本TaKaRa公司的植物RNA提取试剂盒提取生长5个月的‘蓝山禾线’茄子植株根、叶、茎、花和果皮样品的RNA,采用琼脂糖电泳和美国Thermo Fisher公司的NanoDrop超微量分光光度计检测RNA质量与浓度。使用日本TaKaRa公司的反转录试剂盒PrimeScript RTMaster Mix合成cDNA,以cDNA为模板扩增SmCOL5基因,再以茄子各组织的cDNA为模板,采用qRT-PCR手段通过引物qRTCOL5-F、qRTCOL5-R(表1)扩增出对应片段并进行荧光检测,以得到SmCOL5基因的表达量。基因克隆PCR反应程序为:95℃预变性30 s;95℃变性5 s,60℃退火30 s,72℃延伸20 s,35个循环;6℃保存。qRT-PCR的反应程序为:95℃预变性30 s;95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,45个循环;溶解曲线分析95℃,10 s;65℃,60 s;97℃,1 s。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in the test

1.3 基因及其编码蛋白的生物信息学分析

所用到的氨基酸序列下载自NCBI网站。利用ExPASy网站(http:∕∕web.expasy.org∕compute_pi∕)预测SmCOL5蛋白的分子量和理论等电点。利用EMBL-EBI(https:∕∕pfam.xfam.org∕search∕sequence)对其结构域进行预测。

1.4 SmCOL5蛋白的亚细胞定位

设计带有相关同源臂的目的基因的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix试剂盒以cDNA为模板扩增目的片段,使用日本TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒对实验室保存的PHB-YFP载体进行酶切,YFP在特定条件下可以激发出黄色荧光,可用于检测与其相连的片段在何处表达。将目的片段用同源重组的方法连接到剪切过的PHB-YFP载体上,将适量上述质粒与GV3101农杆菌液混匀,依次进行冰浴、浸液氮、37℃金属浴、冰浴,将所得菌液置于摇床培养,再采用涂布平板法培养获得单克隆,挑取单克隆置于含有Rifampicin的培养基中筛选,即可得到带有目的基因片段的农杆菌,将菌株在28℃条件下于LB液体培养基中培养至适当浓度,然后将菌株悬浮于MS缓冲液中(含有10 mmol∕L MgCl2和10 mmol∕L MES的100 mL MS悬浮液,pH 5.8),黑暗条件下静置2 h后选取生长1个月的幼嫩烟草叶片,用摘下针头的1 mL注射器将重组组悬浮液和仅含PHB-YFP载体的悬浮液从叶片背部缓缓注入叶片。2—3 d后使用TCSSP5-II激光共聚焦显微镜(Leica,德国)检测细胞中的YFP信号。

1.5 酵母双杂交试验

设计带有相关同源臂的目的基因SmCOL5和SmCOP1的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix试剂盒以茄子cDNA为模板扩增目的基因片段,将SmCOL5片段用同源重组的方法连接到pGADT7载体上,形成SmCOL5-AD重组体,将SmC OP1基因片段连接到pGBKT7载体上形成SmCOP1-BD重组体。将构建好的带有SmCOL5基因的质粒与带有SmCOP1基因的质粒混合,同时设置对照(SmCOL5-AD×BD和SmCOP1-BD×AD),共转化MATα型AH109酵母感受态细胞。将转化后的酵母菌置于SD-Leu-Trp固体培养基(二缺板)中培养,2 d后挑取单克隆悬浮后滴于SD-Leu-Trp-His固体培养基(三缺板)、SD-Leu-Trp-His-Ade固体培养基(四缺板)上培养,观察菌落生长情况。

1.6 酵母单杂交试验

设计带有相关同源臂的目的基因SmCOL5和结构基因SmF3H、SmCHS启动子的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix试剂盒以茄子cDNA为模板扩增目的基因片段,将目的片段用同源重组的方法连接到pB42AD载体上,以茄子DNA为模板扩增结构基因启动子序列,启动子片段连接到实验室保存的pLacZi载体上。这是一种含有PCYC1启动子和LacZ基因的载体,当上游的PCYC1被激活后,促使LacZ基因表达,在X-Gal环境下,使酵母细胞呈现蓝色。将构建好的带有SmCOL5基因的质粒与带有结构基因启动子片段的质粒分别混合,同时设置对照组(Pb42AD-SmCOL5×pLacZi、Pb42AD×pLacZi-SmF3H、Pb42AD×pLacZi-SmCHS以及Pb42AD×pLacZi),然后共转化MATα型EGY48酵母感受态细胞,并于SD-TU培养基中培养。2—3 d后挑取单克隆悬浮后滴于含有X-Gal的定性培养基上培养,观察菌落颜色。

2 结果与分析

2.1 SmCOL5蛋白的生物信息学分析、组织特异性表达及亚细胞定位

光响应表达模式分析表明(图1),光敏型茄子‘蓝山禾线’中SmCOL5蛋白的表达量在茄子开袋后随光照的变化而变化,其表达量在4 h时达到最高,而SmCOL5蛋白在非光敏型茄子FGM中的表达量相对较低,且变化不明显,说明SmCOL5蛋白在茄子中的表达由光照诱导。

图1 SmCOL5蛋白在光敏型茄子(‘蓝山禾线’)和非光敏型茄子(FGM)中的表达量变化Fig.1 Expression changes of SmCOL5 protein in photosensitive eggplant(‘Lanshanhexian’)and non photosensitive eggplant(FGM)

生物信息学分析发现,SmCOL5基因编码区长度为1 161 bp,编码386个氨基酸;经ExPASy网站预测可知,其蛋白分子量为42.48 ku,理论等电点为5.95;Prabi在线预测表明,SmCOL5蛋白由56.72%无规则卷曲、32.13%α-螺旋、8.85%延伸连和2.30%β-折叠组成。

以成熟茄子的根、茎、叶、花和果皮的cDNA作为模板,通过qRT-PCR进行组织表达特异性分析,发现SmCOL5蛋白在根、茎、叶、花和果皮中均有表达,在叶中的表达量最高,在根中的表达量最低(图2)。

图2 SmCOL5蛋白在茄子不同器官中的表达量Fig.2 Expression of SmCOL5 protein in different organs of eggplant

为了明确目的基因在细胞中的表达情况,将含有PHB-SmCOL5-YFP载体的悬浮液注射于幼嫩烟草叶片的表皮细胞,以含有PHB-YFP载体的悬浮液作为对照,用激光共聚焦显微镜观察,发现注射了重组组悬浮液的叶片细胞核发出黄色荧光,而对照组叶片的细胞质膜和核内均检测到黄色荧光,表明SmCOL5蛋白定位于细胞核中(图3)。

图3 SmCOL5蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of SmCOL5 protein in tobacco leaves

2.2 SmCOL5蛋白与SmCOP1蛋白互作

酵母双杂交试验结果表明,带有pGADT7-SmCOL5与pGBKT7-SmCOP1质粒的酵母在三缺板上可正常生长,在四缺板上也长出了类似单克隆的菌斑,而对照组((SmCOL5-AD×BD和SmCOP1-BD×AD)不论在三缺板还是四缺板上都不能正常生长(图4),说明SmCOL5蛋白能与SmCOP1蛋白在酵母中互作,即SmCOL5转录因子功能受到SmCOP1蛋白的影响,参与到植物的光响应生理活动中。

图4 SmCOL5蛋白与SmCOP1蛋白酵母双杂交结果Fig.4 Yeast two-hybrid results of SmCOL5 protein with SmCOP1 protein

2.3 SmCOL5蛋白与SmF3 H、SmCHS基因的启动子结合

在酵母单杂交试验中,若调控基因可与结构基因启动子结合,则共转化酵母菌菌落将呈现蓝色,而对照仍呈现白色。如图5所示,SmCOL5蛋白与SmF3H、SmCHS基因启动子混合的菌体均呈现蓝色,而对照组(Pb42AD-SmCOL5×pLacZi、Pb42AD×pLacZi-SmF3H、Pb42AD×pLacZi-SmCHS以及Pb42AD×pLacZi)全部呈现白色,说明SmCOL5蛋白可与SmF3H、SmCHS基因的启动子结合,推测SmCOL5蛋白可能对这2个结构基因的转录进行调控,即SmCOL5蛋白可以参与花青素生物合成的调节。

图5 SmCOL5蛋白与SmF3 H、SmCHS基因启动子的酵母单杂交试验Fig.5 Yeast one-hybrid assay of SmCOL5 protein with promoters of SmF3 H and SmCHS genes

3 讨论

BBX基因家族作为植物王国中重要的转录因子家族,其基因功能研究主要集中在拟南芥、水稻和苹果等作物上,研究内容主要包括植物光形态建成、植物抗性和开花等方面。随着各界对花青素的关注度日益提高,BBX家族基因影响花青素累积的研究也逐渐增多。在拟南芥中已知的BBX家族基因对花青素累积有影响,如AtBBX21基因参与拟南芥的UV-B光形态建成,低剂量、长波长的UV-B能诱导植物的花青素累积[13];而在苹果中,MdBBX20和MdBBX24基因能响应UV-B和温度的变化,调控苹果中花青素的累积,从而影响苹果着色[14];在水稻中,OsBBX14基因可以正调控花青素的生物合成[15]。关于BBX家族基因的研究在其他植物中已经较为常见,但在茄子中却鲜有研究。本试验发现,茄子SmCOL5基因的表达量变化与光照量相关联,由此可以初步确定其与植物的光形态建成相关,且SmCOL5蛋白可与SmCOP1蛋白互作,并结合下游调控花青素生物合成的结构基因启动子,从而可能参与调控茄子中的花青素生物合成途径。如前述研究,在苹果的花青素生物合成中,MdBBX20蛋白能特异性识别下游的MdANS基因的启动子,并促进其表达,这一调控机理与本试验结果类似。此外,MdBBX37蛋白可与MdMYBs蛋白和MdHY5蛋白互作,共同影响花青素的生物合成[16],这也为研究SmC OL5基因在茄子花青素合成调控中的作用提供了更多的理论依据和方法参照。

为了进一步确定SmC OL5基因参与调控茄子花青素生物合成的机理,后续将通过设计双荧光素酶报告、瞬时过表达、稳定过表达等试验来验证SmCOL5基因的功能,完善茄子花青素合成调控网络,从而为育成更高花青素含量的茄子奠定坚实基础。