基于SSR分子标记的栎属植物资源的亲缘关系分析

关 媛,吕秀立,于泽群,李秀芬,李水根,刘群录3,朱建军

(1上海市农业科学院林木果树研究所,上海 201403;2上海市园林科学规划研究院,上海 200232;3上海交通大学设计学院,上海 200240)

栎属植物(QuercusL.)是壳斗科(Fagaceae)栎属(Quercus)重要树种,为落叶或常绿乔木,也是少数几个基因组已经测序的模式树种[1]。栎属有400个种,主要分布在北美洲、欧洲、亚洲和北非[2],我国有110余种,各地均有分布。狭义的栎属即定义的栎亚属,全世界约有300种,中国有51个种、14个变种和1个变型[3]。栎树在木材、工业原料、环境绿化和生态修复等方面具有重要价值[4-6]。树皮可药用,栓皮栎的树皮可做红酒的软木塞;木材质量很好,是家具、地板、农具、车辆等的优良用材。此外,栎树也是水源涵养和水土保持林的良好树种,并对有害气体及逆境具有高度抗性,可作为园林绿化树种。近年来,随着城市绿化品质的提高,上海市相继引入耐盐碱、耐水湿的弗吉尼亚栎(Quercus virginiana)、沼生栎(Quercus palustris)、纳塔栎(Quercus nuttallii)等,沼生栎和纳塔栎等在秋季叶色变红,缓解了香樟和广玉兰等景观树种单一的问题[7-8]。最重要的是城市绿化引种高大乔木,将充实绿地群落的上层骨干树种,增加群落的生物多样性,极大地丰富园林景观[9]。

SSR分子标记技术具有共显性、易于操作、重复性好的特点,已经广泛的应用于许多林木的遗传多样性研究[10-14]。本研究利用筛选的SSR标记对栎属4个种24个单株进行遗传多样性分析,以期为该物种的资源利用及引种评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

从中国江苏和美国不同地区引进4个种栎属植物,共100份种质资源,播种在上海市农业科学院林木果树研究所苗圃内,生长6个月后,根据表型选取24份栎属植物种质资源进行分析。分别是来自中国江苏的麻栎(Quercus acutissima),编号为Qa-1—Qa-8;美国佛罗里达州的墨西哥白橡(Quercus polymorpha),编号为Qp-1—Qp-8;弗吉尼亚栎(Quercus Virginiana),编号为Qv-1—Qv-4;来自美国俄勒冈州的沼生栎(Quercus palustris),编号为Qpa-1—Qpa-4。每份材料取新鲜嫩叶,存于-70℃超低温冰箱中待用。

1.2 基因组DNA的提取

采用CTAB法[15]提取栎属植物基因组DNA,改良后的方法如下:取100 mg栎树叶片,放入2 mL离心管中,加入钢珠,在液氮中速冻后在研磨仪上研磨。研磨完全后加入改良的CTAB溶液[2%CTAB,100 mmol Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol EDTA,1.4 mol NaCl,2%PVP,1%β-巯基乙醇],充分混匀,65℃水浴20 min。加入等体积的氯仿∕异戊醇(24∕1,V∕V),充分混匀后12 000 r∕min、4℃离心10 min,将上清液转移至新的离心管中。加入等体积预冷的异丙醇,混匀,12 000 r∕min、4℃离心10 min,倒掉上层溶液,在有DNA沉淀的离心管中加入500μL 70%乙醇,摇晃两下,然后12 000 r∕min 4℃离心5 min,倒掉废液,将离心管干燥10 min以上,加入包含RNase的灭菌水(990μL灭菌水加上10μL RNase)50μL,溶解后,用1%琼脂糖电泳检测DNA完整性,并用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度。-20℃冰箱保存待用。

1.3 SSR标记分析

PCR反应体系为:基因组DNA 30 ng,0.5μmol引物,200μmol dNTPs,2 mmol MgCl2,1×Taq buffer、1 U Taq DNA聚合酶,总反应体系为20μL。PCR反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,51.5—55℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存扩增产物。PCR产物先用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出有特异性条带的PCR产物,再用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,恒定电压200 V,电泳2 h。电泳结束后银染,用相机成像保存。SSR引物序列参照Hardwood Genomics Project(https:∕∕www.hardwoodgenomics.org∕organism∕Quercus∕alba)网站序列,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物信息见表1。

表1 SSR分析所用的引物序列Table 1 The sequences of primers used in SSR analysis

1.4 数据统计分析

根据分子量大小对各引物扩增出的等位基因进行排序,在电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”,同一位置没有条带的记为“0”,建立0∕1矩阵。用NTSYS-pc 2.1软件计算遗传相似系数,获得相似系数矩阵。以非加权类平均法(UPGMA)进行聚类分析,构建树状聚类图。采用PopGENE 32软件计算等位基因数、有效等位基因数、Shannon多样性指数、Nei基因多样性指数。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的多态性分析

用24份不同种的栎属植物资源基因组DNA作为模板进行PCR扩增,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示从44对SSR引物中筛选出13对扩增片段清晰的引物,如图1所示,利用引物20458对24份栎属植物材料进行PCR扩增,其产物通过琼脂糖凝胶电泳检测可获得清晰的条带,并且不同材料扩增的片段大小不同。为了更好地检测不同材料的等位基因,利用非变性聚丙烯酰胺凝胶检测片段的差异,其中9对多态性引物扩增结果可用于数据统计分析。这9对引物在24份材料中共检测到62个等位基因变异,每对引物检测到的等位基因变异范围为4—12个,平均每对引物检测到6.9个等位基因。其中引物46284检测到的等位基因最多,为12个。如图2所示,引物38169对24份栎属植物样品扩增出的条带介于100—150 bp。各位点的平均有效等位基因为4.96,Nei多样性指数分布范围在0.628 5—0.891 5,平均每个位点为0.758 6,Shannon信息指数分布范围为1.184 3—2.336 7,平均每个位点为1.635 7(表2)。

表2 24份栎属植物材料的遗传多样性Table 2 The genetic diversity of the 24 Quercus resources

图1 SSR引物20458扩增结果Fig.1 The amplification results of primer 20458

图2 SSR引物38169的扩增结果Fig.2 The amplification results of primer 38169

2.2 SSR标记的聚类分析

由图3所示,24份种质资源间遗传相似系数的平均值为0.700 8,变化范围为0.492 8—0.971 0,其中Qpa-4和Qp-1遗传相似系数最低。聚类结果显示,在遗传相似系数0.65处,引种的栎属资源可以分为两大类,第Ⅰ类为中国江苏收集的麻栎,第Ⅱ类为美国收集的3个种的引种资源,其中沼生栎和弗吉尼亚栎聚为一类,墨西哥白橡单独聚为一类(图4)。在遗传相似系数0.82处,24个栎属资源可以清晰的分成四类。其中弗吉尼亚栎的Qv-2和Qv-3、墨西哥白橡的Qp-5和Qp-8遗传相似系数最高,为0.971 0。SSR标记的聚类结果和不同种的植物分类学结果基本一致,可以很好的将不同种的栎属资源划分开。

图3 24份栎属植物资源遗传相似系数Fig.3 The genetic similarity co-efficient of the 24 Quercus resources

图4 24份栎属植物资源SSR聚类分析Fig.4 The clustering map of the 24 Quercus resources by SSR markers

3 结论与讨论

SSR分子标记具有共显性、扩增稳定、重复性好的特点,是常用的遗传多样性分析方法之一,但利用SSR标记对栎属植物进行遗传多样性分析的研究较少。徐小林等[16]利用16对SSR标记对我国栓皮栎天然群体进行遗传多样性分析,发现平均等位基因数为8.43个,有效等位基因数平均为5.95个,平均Nei多样性指数为0.804 1,Shannon信息指数为1.830 8。秦英英等[17]利用11对SSR标记对辽东栎天然群体进行遗传多样性分析,发现平均等位基因数为10.27个,有效等位基因数平均为5.19个,平均Nei多样性指数为0.752 1,Shannon信息指数为1.754 3。本研究中,9对SSR引物在24份材料中检测到平均等位基因数为6.9个,平均有效等位基因为4.96,平均Nei多样性指数为0.758 6,Shannon信息指数为1.635 7,说明不同种的栎属植物遗传多样性水平较高,差异较大。本研究中,平均等位基因数、平均Shannon信息指数、平均Nei多样性指数都略低于以往的研究结果,推测是因为研究材料不同所致。

对栎属植物天然群体来说,较高的遗传多样性水平是保持群体稳定的基础。魏高明[18]利用SSR分子标记技术对苏浙皖地区的4个栎属树种,共300个个体进行遗传结构与遗传变异研究,结果显示4个树种不仅存在较高的遗传多样性,而且普遍具有基因渐渗现象。郭斌[19]利用9对SSR标记对辽东栎、蒙古栎、北美红栎和猩红栎进行聚类分析,发现北美红栎和猩红栎聚为一类,为一个混合组,这是因为栎属植物为风媒异交,花粉具有很强的长距离传播能力,种子传播能力也很强,因此栎属植物在自然状态下,种之间界限模糊,种间杂交或渐渗情况频繁。麻栎是中国主要的栎属树种,广泛分布于全国各地,本研究中,麻栎单独聚为一类,而引种自美国的3个树种聚为一大类,这和引种母株的地理分布有关。其中,弗罗里达州的墨西哥白橡单独聚为一亚类,弗吉尼亚栎和沼生栎聚为一亚类,这两种栎在秋季叶片变红,而墨西哥白橡没有这样的性状,与形态学结果相似。弗吉尼亚栎在美国东南部分布较广,为美国栎属植物的重要代表,它和沼生栎生长习性及表型差异很大,推测两个树种之间有基因渐渗现象[20]。本研究中,有2份墨西哥白橡和2份弗吉尼亚栎聚类分析没有分开,推测是因为采用的分子标记数量不足所致。

我国对栎属植物的引种历史悠久,引入中国的栎类树种大约20余种,在长三角地区优选了5种北美栎树,这些主要集中用于引种试验研究[21]。而对这些引种树种进行鉴定、遗传多样性评价的研究还很少。本研究结果表明,在上海引种的4种栎属植物的遗传多样性较高,利用SSR分子标记用于分析栎属植物种间的亲缘关系,方法简单,结果可靠,研究结果可为栎属植物引种管理、鉴定、保护及评价提供重要依据。引种群体是由种子繁殖而来,所以种内差异较小,用SSR标记技术进行种内资源关系鉴定,还需要更多的有效引物。