深圳市408份不同来源样本弯曲菌的检测及耐药特征分析

马艳萍，鞠长燕，刘 敏，段永翔，何娇明，马佳智，俞慕华，张茂俊

弯曲菌为人兽共患病原菌，广泛寄生于畜禽类动物以及人类的肠道内。大部分弯曲菌感染可引起人类急性腹泻性肠炎，特异菌型菌株的感染会引起格林巴利综合征、反应性关节炎等严重并发症[1]。在欧美等发达国家弯曲菌感染导致的肠炎占首位，弯曲菌的感染现状已经超过临床上常见肠道致病菌(沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌等)，弯曲菌同时也是这些发达国家食源性病原菌感染的主要监测病原菌[2]。

我国以前使用传统方法分离弯曲菌，检出率很低。2016年开始使用滤膜法进行弯曲菌的分离培养，分离率大幅提高[3-4]。北京顺义地区腹泻病人弯曲菌的分离率由2014—2016年0%增加到10.48%[4]。2016年深圳地区禽肉和腹泻病人空肠弯曲菌分离率分别为40.7%和5.5%[3,5]，但目前国内外蔬菜、海鲜的弯曲菌检出少见报道。

2019年本课题组应用过滤法对深圳市腹泻病人，鸡肉、鸡盲肠、牛肉、猪肉、生菜和海鲜7种不同来源样本进行弯曲菌的流行与耐药特征分析，与往年菌株的耐药特征进行比对，获得深圳地区弯曲菌的流行现状及耐药变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源 本课题组从2019年6—9月共收集不同来源样本408份，包括腹泻病人159份、鸡肉69份、鸡盲肠50份、牛肉30份、猪肉30份、生菜31份和海鲜39份。

1.1.2 试剂与仪器 弯曲菌检测试剂盒(ZC-CAMPY-001，青岛中创生物科技有限公司)，弯曲菌琼脂稀释法抗生素最低抑菌浓度(MIC)检测试剂盒(ZC-CAMPY-013，青岛中创生物科技有限公司)，弯曲菌琼脂基础(Karmali)(Oxoid公司)，弯曲菌 (食源性弯曲菌属、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、红嘴鸭弯曲菌) 四重核酸检测试剂盒(荧光PCR法)(深圳生科源有限公司)，4950E三气培养箱(NUAIRE公司)，CFX96 Touch 荧光定量PCR仪(BIO-RAD公司)，全自动核酸提取工作站(罗氏公司)。

1.2 方 法

1.2.1 样品采集

1.2.1.1 病人纳入标准 执行WS271-2007《感染性腹泻诊断标准》中感染性腹泻诊断依据。取绿豆大小的粪便放入粪便样本采集液，2 h内送回实验室。

1.2.1.2 肉类样本及生菜样本 称取样本250 g放于一次性无菌密封袋中，取出试剂盒中的BPW缓冲液，稀释10倍后适量加入到袋中淹没样品反复揉搓，充分漂洗后，放4 ℃过夜。

1.2.1.3 鸡盲肠样本 从屠宰场用无菌密封袋收集鸡整个肠部，2 h送回实验室，在实验室用无菌镊子剪下鸡盲肠部分，加入到稀释10倍的BPW缓冲液。

1.2.2 增菌及分离 按照试剂盒说明书，吸取1 mL样本采集液或漂洗液加于4 mL促生长增菌液中，37 ℃微需氧(5% O2，10% CO2，85% N2)培养24 h，吸取600 μL滴加双孔板(Karmali和哥伦比亚血平板)的滤膜上，约1 h后揭去滤膜，翻转平板，置于微需氧环境37 ℃培养24 h。

1.2.3 四重PCR检测和鉴定 用接种环刮取双孔板上单菌落纯培养(至少挑取5个)，DNA核酸提取采用Roche机器提取试剂盒。采用弯曲菌四重荧光PCR检测试剂盒进行弯曲菌的鉴定。

1.2.4 药敏方法 药敏试验采用琼脂稀释法为基础的试剂盒，成品试剂盒将11种含有不同浓度抗生素的MH琼脂包被到96孔板中，获得弯曲菌的最小抑菌浓度(MIC)。质控菌株为本实验室保存的空肠弯曲菌(ATCC33560)。采用2014年美国国家耐药监测中心(National Antimicrobial Resisitance Monitoring System, NARMS)(http://ars.usda.gov/Main/docs.htm.docid=6750)细菌耐药标准来判断弯曲菌的敏感、中介、耐药。弯曲菌菌株对三类及三类以上抗生素耐药特征为多重耐药性。

1.3 结果分析 采用SPSS 22.0进行统计学分析，使用χ2检验进行组间计数资料的比较，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 弯曲菌的分离情况与流行病学分析 采集408份不同来源的样本，不同来源样本的分离率见表1，其中鸡盲肠的弯曲菌阳性率最高，达72.0%(36/50)，鸡肉的分离率次之，为49.3%(34/69)。腹泻病人弯曲菌分离率为10.7%(17/159)。牛肉、猪肉弯曲菌分离率低，海鲜中分离到1株空肠弯曲菌，生菜未分离到弯曲菌。

表1 不同来源样本弯曲菌分离数及阳性率Tab.1 Number and positivity rates of Campylobacter isolated from different samples

共采集腹泻病人粪便样本159份，弯曲菌阳性率为10.7%(17/159)。17株弯曲菌中，空肠弯曲菌13株，结肠弯曲菌2株，简明弯曲菌2株。弯曲菌阳性病例临床表现主要为腹泻，其中糊状便占76.5%(13/17)，水样便占17.6%(3/17)，成型便占5.9%(1/17)。腹泻病人不同年龄组存在差异，46岁以上年龄组弯曲菌阳性率(27.8%)高于10～45岁年龄组(7.9%)，差异有统计学意义(χ2=4.352，P=0.037)。

2.2 菌株抗生素敏感性特征 13株腹泻病人和40株鸡源空肠弯曲菌菌株耐药结果见表2。2种来源空肠弯曲菌菌株对萘啶酸、环丙沙星和四环素的耐药率均高于90%。值得注意的，2种来源空肠弯曲菌菌株对氟苯尼考的耐药率均高于75%。空肠弯曲菌的总体耐药梯度为喹诺酮类、四环素、氯霉素类、林可酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类。53株空肠弯曲菌菌株有39株存在多重耐药性(11株人源，28株鸡源)，其中有8株(人源2株，鸡源6株)空肠弯曲菌对11种抗生素全部耐药。腹泻病人来源和鸡源空肠弯曲菌常见的耐药谱为萘啶酸-环丙沙星-四环素-氟苯尼考，耐药率分别为69.2%(9/13)和65%(26/40)，差异无统计学意义(χ2=0.000，P=1.000)。

表2 13株腹泻病人和40株鸡源空肠弯曲菌菌株耐药结果Tab.2 Drug resistance of 13 patients with diarrhea and 40 Campylobacter jejuni strains from chickens

2株腹泻病人和30株鸡源结肠弯曲菌菌株耐药结果见表3。32株结肠弯曲菌菌株对萘啶酸、环丙沙星和四环素全部耐药。值得注意的是，32株结肠弯曲菌对氟苯尼考的耐药率高达62.5%(20/32)。32株结肠弯曲菌菌株全部存在多重耐药性，其中4株鸡源结肠弯曲菌对11种抗生素全部耐药。

表3 2株腹泻病人和30株鸡源结肠弯曲菌菌株耐药结果Tab.3 Drug resistance results of two strains of Campylobacter coli isolated from patients with diarrhea and 30 strains from chickens

注：ERY：红霉素；AZI：阿奇霉素；NAL：萘啶酸；CIP：环丙沙星；GEN：庆大霉素；STR：链霉素；CHL：氯霉素；FLO：氟苯尼考；TET：四环素；TEL：泰利霉素；CLI：克林霉素。图1 2种来源弯曲菌的耐药谱Fig.1 Drug resistance spectrum of Campylobacter from two sources

2.3 与往年弯曲菌的流行及耐药特征的比对分析 2019年腹泻病人来源空肠弯曲菌分离率和2016年(5.3%，23/437)差别无统计学意义(χ2=1.743，P=0.187)。2019年鸡肉来源空肠弯曲菌分离率和2016年(36.5%，23/63)差别无统计学意义(χ2=0.313，P=0.576)。

2019年腹泻病人分离的空肠弯曲菌菌株萘啶酸-环丙沙星-四环素-氟苯尼考多重耐药(69.2%，9/13)高于2016年(30.4%，7/23)，差异有统计学意义(χ2=5.063，P=0.024)。

3 讨 论

污染的禽畜类动物是人类弯曲菌感染的主要来源[6]。本研究中，深圳地区鸡肉与鸡盲肠中弯曲菌检出率较高，为49.3%和72%，牛肉、猪肉、生菜和海鲜中弯曲菌的检出率较低(≤3.3%)。2020年Zbrunab等[7]的meta分析表明鸡是弯曲菌的主要传染源，与本研究结果一致。2016年本课题组鸡肉、牛肉中空弯曲菌检出率分别为36.5%、1.1%[3]。四川省鸡盲肠、江苏省、山东省青岛市鸡肉弯曲菌检出率分别为56.1%、46.7%、34.66%[8-10]。西班牙北部鸡肉、鸡粪弯曲菌检出率分别为35.4%、62%[11]。上述国内外鸡肉和鸡粪(鸡盲肠)中弯曲菌检出均低于本研究，说明深圳地区鸡源弯曲菌污染严重，且呈递增趋势。深圳地区猪源弯曲菌污染(3.3%，1/30)低于中国东部地区(19.3%，333/1 726)[12]。弯曲菌在法国某海岸线的贝类样品中检出率为26.6%[13]。本研究深圳地区生菜中未检出弯曲菌，39份海鲜样品检出1株空肠弯曲菌，中国其他地区生菜和海鲜样品弯曲菌的检出率未见报道。

2019年腹泻病人空肠弯曲菌分离率(8.2%)与2016年(5.3%)进行比较，空肠弯曲菌分离阳性率增加，但差异无统计学意义(χ2=1.743，P=0.187)。鸡源空肠弯曲菌的差异也无统计学意义，说明2016—2019年3年深圳地区腹泻病人和鸡源空肠弯曲菌的感染无明显变化。2017—2018年北京地区腹泻人群中弯曲菌的检出率为7.81%[14]，与本研究差别无统计学意义。值得注意的是，深圳地区46岁以上年龄组弯曲菌分离率(27.8%)高于(10～45岁)年龄组(7.9%)，这与2017年北京顺义地区(弯曲菌感染以16～30岁病例居多，达14.5%)[4]和加纳地区弯曲菌的分离(以10～29岁年龄组为主，为34.3%)[15]有差异，说明弯曲菌的感染存在地区和年龄差异。

印度地区鸡盲肠来源弯曲菌耐药从高到低依次为喹诺酮类(>90%)、四环素(39.3%)、红霉素(13.4%)，而对氯霉素、链霉素和庆大霉素敏感(耐药<2%)[16]。本研究鸡源弯曲菌对抗生素的耐药率除喹诺酮类和四环素高于90%，其他几种抗生素耐药率均高于30%。说明深圳地区弯曲菌耐药现象比印度地区更严重。2019年鸡源空肠弯曲菌对红霉素、阿奇霉素、泰利霉素和克林霉素的耐药高于2016年，且腹泻病人分离的空肠弯曲菌对萘啶酸-环丙沙星-四环素-氟苯尼考多重耐药(69.2%，9/13)高于2016年(30.4%，7/23)。说明深圳地区弯曲菌耐药现象增强，且存在多重耐药现象，尤其大环内酯类抗生素作为一线抗菌药物[17]，耐药性也在增加，应引起广大部门的注意。

本研究腹泻病人来源弯曲菌对氟苯尼考抗生素存在高耐药性(空肠弯曲菌为76.9%，结肠弯曲菌为50.0%)。北京顺义地区腹泻病人来源空肠弯曲菌、结肠弯曲菌对氟苯尼考耐药率分别为46.05%和0[18]。RE-Cme ABC外排泵可能是导致近几年氟苯尼考在禽畜空肠弯曲菌高耐药的原因[19]。氟苯尼考一直在禽畜中使用，但在人源中也有较高的耐药率，需要进一步研究其在人源中产生耐药的原因。