北京市顺义区零售生猪肉中小肠结肠炎耶尔森菌的检测与病原特征分析

张彦春，杨 波，王 苗，冀国强，马红梅，李 颖，张茂俊

小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)可导致耶尔森菌病[1-2]，广泛分布于自然界，是少数几种能在冷藏温度下生长的肠道致病菌之一，该菌天然寄居在多种动物体内，通过污染食物(牛奶、猪肉等)和水经粪-口途径感染或因接触染疫动物而感染[3-5]。Y.enterocolitica的毒力基因主要有5种，其中包括染色体源毒力基因ail、ystA、ystB和质粒源毒力基因yadA、virF，与人腹泻密切相关[6]。Y.enterocolitica嗜冷，因此欧洲高纬度国家耶尔森菌病流行强度较高[3-5]。北京虽处于温带地区，但冬季时间长且气温低，极有可能具备Y.enterocolitica流行的先决条件。

因体外培养Y.enterocolitica菌落小且菌落特征不典型，造成实验室分离培养Y.enterocolitica难度增加，通常需要经验丰富技术人员的仔细甄别，容易造成菌落遗漏和错误识别。本研究对70份零售生猪肉样品进行Y.enterocolitica检测，为提高分离培养阳性率，本研究在传统增菌分离培养方法的基础上增加了对增菌液进行Y.enterocolitica特异基因荧光PCR预筛查检测，旨在准确获得本地区零售生猪肉中Y.enterocolitica分布及病原特征。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品来源 采集来自北京顺义区超市和小型市场零售摊位的生猪肉样品，采样时间2019年3月至2020年10月，共计70件。样品采集后4 ℃暂存，2 h内送入顺义区疾病预防控制中心实验室检测。

1.1.2 主要仪器与试剂 耶尔森选择培养基为美国OXOID公司产品；改良磷酸盐缓冲液(PSB)、胰酪大豆琼脂(TSA)、改良克氏双糖铁(KIA)为北京陆桥公司产品；脉冲场凝胶电泳试验使用的Tris-Hcl、EDTA、SDS、TBE、蛋白酶K为索莱宝公司产品；NotI、XbaI内切酶为美国NEB公司产品；传统PCR反应液(Premix TaqTMVersion 2.0)为TaKaRa公司产品；小肠结肠炎耶尔森菌荧光PCR检测试剂盒(foxA基因)为北京卓成惠生公司产品(A2160)；小肠结肠炎耶尔森菌多重荧光PCR鉴定及毒力基因分型检测试剂盒为青岛中创汇科生物制品有限公司产品；荧光定量PCR仪(美国伯乐CFX96 Tough型)，脉冲场凝胶电泳仪(美国伯乐CHEF Mapper)、细菌鉴定仪(法国梅里埃公司VITEK 2 compact)。

1.2 方 法

1.2.1Y.enterocolitica分离培养 将25 g生猪肉样本加入225 mL改良磷酸盐缓冲液中进行4 ℃冷增菌，时间为20 d。用10 μL 接种环取1环增菌液接种耶尔森选择培养基26 ℃培养48 h，Y.enterocolitica可疑菌落中央深红色且周围具有无色透明圈。参照《食品安全国家标准食品微生物检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》(GB4789.8-2016)中分离培养步骤，挑取5个可疑单菌落接种改良克氏双糖铁琼脂，然后挑取培养物进行foxA基因荧光PCR检测，foxA基因阳性菌落转种TSA平板26 ℃纯培养24 h，纯培养菌落使用全自动细菌鉴定仪鉴定。

1.2.2 增菌液荧光PCR预筛查检测 改良磷酸盐缓冲液冷增菌20 d后吸取200 μL至EP管中，100 ℃金属浴加热10 min，8 000 r/min离心10 min，取上清作为模板进行foxA基因荧光PCR预筛查检测。若增菌液荧光PCR筛查foxA基因阳性而Y.enterocolitica培养阴性，则将增菌液重新接种耶尔森选择培养基26 ℃培养48 h，挑取更多可疑单菌落进行foxA基因荧光PCR检测，直至挑取到foxA基因阳性单菌落，然后纯化培养并进行细菌生化鉴定。

1.2.3 分离株毒力基因、分子分型和抗生素敏感性检测 将生猪肉中分离的Y.enterocolitica阳性菌株和本地区2017-2019年腹泻病例中分离的3个Y.enterocolitica菌株进行毒力基因(ail、ystA、ystB、yadA、virF)普通PCR检测[6]、毒力基因荧光PCR检测(小肠结肠炎耶尔森菌多重荧光PCR鉴定及毒力基因分型检测试剂盒)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型检测[7]和抗生素敏感性试验(上海星佰革兰阴性需氧菌药敏检测板，D板)。PFGE指纹图谱(NotI酶切)上传国家致病菌识别网进行比对分析。耐药、中介、敏感的判定依据为CLSI M100-S28。抗生素包括青霉素类：氨苄西林(Ampicillin, AMP)、氨苄西林/舒巴坦(Ampicillin/Sulbactam, AMS)；一代头孢：头孢唑林(Cefazoin, CFZ)；二代头孢：头孢西丁(Cefoxitin, CFX)；三代头孢：头孢他啶(Ceftazidime, CAZ)、头孢噻肟(Cefotaxime, CTX)；碳青霉烯类：亚胺培南(Imipenem, IMP)；大环内酯类：阿奇霉素(Azithromycin, AZM)；四环素类：四环素(Tetracycline，TET)；喹诺酮/氟喹诺酮类：萘啶酸(Nudic Acid, NAL)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)；氯霉素类：氯霉素(Chloramphenicol, CHL)；氨基糖苷类：庆大霉素(Gentamicin, GEN)；磺胺类：复方磺胺(Trimeth-sulfame, SXT)；测试抗生素共包括7大类14种(青霉素类、头孢类和碳青霉烯类均归为β内酰胺类)。

1.2.4 统计学分析 结果用SPSS 25.0进行统计学分析，采用卡方检验，检验水准α=0.05(双侧)。

2 结 果

2.1 菌株分离情况 70份样品中，6份使用传统增菌培养法Y.enterocolitica分离培养阳性，阳性率8.57%(6/70)；19份增菌液foxA基因荧光PCR预筛查检测阳性(6份传统增菌培养法阳性样本均包含在内)，阳性率27.14%(19/70)；13份增菌液foxA基因预筛查检测阳性，但Y.enterocolitica分离培养阴性样品通过增加挑取可疑菌落数量(20～50个单菌落)的方式最终均成功分离到菌株。4个季节样本检出率差异无统计学意义(χ2=4.390，P值=0.222)；超市和市场零售样本检出率差异无统计学意义(χ2=0.031，P=0.860)；北京市来源和外省市来源肉品检出率差异有统计学意义(χ2=7.802，P=0.005)，见表1。

表1 Y. enterocolitica阳性分离率分布Tab.1 Distribution of isolation rate of Y. enterocolitica isolates

2.2 菌株毒素检测结果和抗生素敏感性检测结果 19株分离自生猪肉的Y.enterocolitica对15种抗生素耐药率由高至低依次为CFZ：94.74%(18/19)，AMP：84.21%(16/19)，CFX：47.39%(9/19)，AMS：42.11%(8/19)，NAL：15.79%(3/19)，CIP：5.26%(1/19)，TET：5.26%(1/19)，CAZ：5.26%(1/19)，优势耐药谱为AMP+CFZ联合耐药，耐药谱见表2。2种方法(传统PCR和多重荧光PCR)检测19株生猪肉分离株5种毒力基因结果具有一致性，且19株Y.enterocolitica携带毒力基因特征均为ail-/ystA-/ystB+/yadA-/virF-；2种方法检测北京顺义地区2017-2019年腹泻病例中分离到3株Y.enterocolitica5种毒力基因结果也具有一致性，见表2。

表2 Y. enterocolitica耐药谱和毒力基因分布Tab.2 Antibiotic resistance spectrum and virulence gene distribution of Y. enterocolitica isolates

2.3 菌株分子分型结果 19株Y.enterocolitica全部进行PFGE分子分型检测，其中2株条带降解，其余17株成功获得PFGE指纹图谱。17株Y.enterocolitica与国家致病菌识别网数据库中北京顺义地区曾上传的3个病例株(BJSY2017Ye001、BJSY2018Ye001、BJSY2019Ye001)进行聚类分析，其中Yes-2019bjsy004和Yes-2019bjsy025为不同采样时间、不同采样地点、但却是同一食品加工企业生产的2份生猪肉样品所分离，菌株带型一致；Yes-2020bjsy031和Yes-2020bjsy032为同一市场、同一摊位采集的2份生猪肉样品所分离，分离菌株带型一致；Yes-2019bjsy(ZC)003和Yes-2019bjsy(ZC)004也为同一市场、同一摊位采集的2份生猪肉样品所分离，菌株带型相似程度为95.74%。其余11个菌株带型相似程度低，呈分散分布，与本地区病例分离株不成簇。见图1。

图1 自生肉和病例分离Y. enterocolitica脉冲场凝胶电泳聚类结果Fig.1 PFGE pattern cluster analysis of Y. enterocolitica isolates from raw meat and patients with diarrhea

3 讨 论

欧洲的相关研究中，Y.enterocolitica在生鲜制品的检出率超过30%[8]，但国内部分研究，生鲜制品中Y.enterocolitica检出率仅有10%，甚至低于5%[9-11]。本研究使用传统增菌培养法Y.enterocolitica阳性率为8.5%(6/70)，而增菌液foxA基因荧光PCR预筛查阳性率为27.14%(19/70)。增菌液foxA基因预筛查阳性而培养法阴性的样品，在增加了从选择性培养基中挑取可疑菌落的数量后(20～50个单菌落)，最终全部成功分离到Y.enterocolitica菌株，说明增菌培养法存在因挑取可疑菌落数不足而造成漏检的问题，结合增菌液荧光PCR预筛查检测，可显著提高生猪肉样品中Y.enterocolitica分离培养阳性率。本研究中发现4个季节Y.enterocolitica检出率差异无统计学意义，超市与市场零售样品检出率差异无统计学意义，但北京市肉源检出率显著高于外省市肉源，这可能是北京市肉源相对外省市肉源的销售周期短，肉制品新鲜程度高相关。

本研究中对17株生肉分离株和本地区2017-2019年3株病例分离株进行了分子分型分析，结果显示Y.enterocolitica带型多样化，无显著遗传聚集性特征，且生肉分离株与病例分离株带型的相似程度低。生猪肉样品分离Y.enterocolitica遗传相似程度与食品生产同源性或销售同源性是否相关，值得在以后的监测中深入研究。

缺少ystA、ail、yadA基因而仅携带耐热性肠毒素B基因(ystB)的Y.enterocolitica菌株无法突破宿主免疫造成感染[12]，本次生猪肉样品中分离19株菌毒力基因携带特征均为ail-/ystA-/ystB+/yadA-/virF-，是非致病生物1A型Y.enterocolitica最常见的毒力基因携带特征[12-13]，用Y.enterocolitica菌种水平识别来评估食品的致病风险存在一定局限，增加ail、ystA、yadA等毒力基因检测，对提升Y.enterocolitica食品风险监测具有一定意义。菌株毒力基因的荧光PCR组合检测可快速获得分离菌株的毒力特征，值得广泛推广。

本研究中Y.enterocolitica对青霉素类(氨苄西林)和一代头孢(头孢唑林)耐药率较高，与国内类似研究结果相似[14-16]。王闻卿等报道上海食源性Y.enterocolitica分离株对三代头孢、氟喹诺酮等抗生素均敏感[14]；本研究中出现耐三代头孢(头孢他啶)菌株和耐氟喹诺酮类(环丙沙星)Y.enterocolitica各1株，耐喹诺酮类(萘啶酸)Y.enterocolitica3株，且北京市顺义区2017和2019年均分离到同时耐头孢他啶、萘啶酸和环丙沙星的病例株，2017年病例株同时耐碳青霉烯类抗生素(亚胺培南)；三代头孢、喹诺酮/氟喹诺酮类、碳青霉烯类等临床常用抗生素对Y.enterocolitica感染的治疗效果可能会降低[16]。Y.enterocolitica对三代头孢、喹诺酮/氟喹诺酮类、碳青霉烯类抗生素的耐药进展应引起临床、畜牧、公共卫生等部门的关注，应加强Y.enterocolitica耐药表型及耐药基因相关监测工作。