婴幼儿配方奶粉中生物素检测的人员比对

梁颖思 黄家欣 陈秀芬 苏妙贞 周露

(广东省食品检验所 广东广州 510435)

1 前言

生物素(Biotion)又称为维生素B7，它是一种维持人体自然生长和正常人体机能所必须的水溶性维生素，但是人体无法通过自身代谢合成[1]。因其在食物中分布广泛，所以一般情况下人体并不缺乏这种维生素，但是婴儿肠道功能不完善，易导致缺乏生物素而患皮炎，且婴幼儿在脱离母乳之后，饮食以配方奶粉及各类辅食为主，因此需在婴幼儿食品中添加适量的生物素以增加婴幼儿对生物素的摄取[1-2]。

实验室人员比对实验是指在相同的仪器设备、实验项目、环境和设施条件下，对性能稳定的操作对象，由不同的实验人员进行试验。只研究1个实验因素即人员，因素中有2个水平，即检验员A与检验员B，通过对不同人员的实验数据进行统计分析，研究人员之间的检验数据有无显著性差异[3]。人员比对是实验室内部质量控制中主要的有效措施之一，有助于了解实验室的检测能力，为实验室检验结果的准确性、重现性、可验证性打下良好基础；同时，通过内部人员比对有助于了解自身不足，量化实验室系统误差，以便采取相应的完善措施[4]。

随着国家对食品安全问题愈发重视，对食品检验机构的能力要求也越来越高，作为食品微生物实验室，应当不断提高检验员的检测能力，增强实验室的质量控制[5]。本文按照GB 5009.259-2016《食品安全国家标准 食品中生物素的测定》与内部质量控制技术要求的规定进行实验，通过对检验员的质量控制，为本实验室的质量控制提供可靠的数据，确保检验数据的准确性。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

水浴锅(德国ika/艾卡ICC basic eco 18)；Ph计(梅特勒-托利多)；离心机(Beckman Allegra 64R)；生物安全柜(新加坡ESCO)；生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；酶标仪(日本岛津)；生物素检测试剂盒(德国拜发公司)。

2.2 样品及质控样品

婴配样品：广东省食品检验所提供的某品牌婴儿配方奶粉2段(营养成分表中生物素含量为12.0 μg/100 g)。

质控样品：购于中国检验检疫科学研究院测试评价中心的婴幼儿配方乳粉(编号为QC-IP-017，证书结果证明样品中生物素的含量指定值为26.00 μg/100 g，满意值范围为21.56～30.44μg/100 g)。

2.3 样品处理

分别称取1 g样品溶入30 ml蒸馏水；用HCl或NaOH调整pH至8.0±0.2，摇匀，用蒸馏水定容40 ml；95℃水浴30 min，每5 min震荡1次，确保离心管塞紧闭；迅速冷却至30℃以下；样品过0.2μm独立包装无菌滤膜；样品系列稀释。

2.4 培养基制备

用镊子取出培养基中的干燥剂袋，加入10 ml无菌水，95℃水浴5 min，每2 min震荡1次，保持瓶子密封，水浴后迅速冷却至室温；用无菌滤膜过滤至一次性无菌离心管中。

2.5 标准品的制备

标准品浓缩液：取试剂盒所带无菌水2 ml至标准品瓶，混匀。

表1 生物素标准曲线制备表

2.6上板

取相应数量的微孔板条至板架，分别加入150 μl的培养基和150μl的标准品或样品：

QC1 QC1 QC1 C1 Std1 Std1 Std1 C2 Std2 Std2 Std2 C3 Std3 Std3 Std3 Std4 Std4 Std4 Std5 Std5 Std5 P1 P1 P1 P2 P2 P2

用试剂盒中的密封胶片将所有微孔密封，然后在36℃黑暗条件下孵育48 h。

2.7 读数

孵育完毕后，将微孔板倒置于桌面，进行震荡使其混匀；之后揭去粘合箔并去除微孔液体表面的气泡，并尽快用酶标仪在630 nm波长下进行读数。

2.8 结果计算

使用R-Biopharm公司提供的RidaWin软件对结果进行分析。

样品中生物素含量(μg/100g)=(标准曲线上读取的样品浓度×稀释倍数)/样品总量

3 结果与分析

3.1 标准曲线绘制

在“RidaWin”软件中，以生物素标准品的质量分数作为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出准曲线。标准曲线质量分数在0～0.72μg/100 g范围内时，2名检验员检测生物素标准曲线的线性关系良好，分别为：R2=0.9994(图1a)和R2=0.9978(图1b)。检验的R2值均大于0.99，符合标准GB/T 27404-2008[6]中线性回归方程相关系数的要求。

3.2 样品及质控样品中生物素的测定

对2名检验员检测结果(表2)进行显著性差异分析，发现两者测定的生物素的数值差异不显著(P>0.05)。

表2 二者对生物素测定的结果

乳粉质控样品生物素的测定值范围是21.56～30.44μg/100g，指定值为26.00μg/100g。二者的测定值均在质控样品测定值的范围内，与指定值相比，检验员A的测定值较低，为5.77%，检验员B的测定值较高，为13.46%，均属于可接受水平(±17.08%)。

测定结果根据内部质量控制的技术要求，进行复现性计算，对各自的测定结果取对数值，以两者实验结果之间的绝对差值不大于复现性限为结果满意[7]，此次的人员比对复现性R=0.03(R<0.45)，故此次人员比对结果为满意。

4 结论

基于王晶、梁美丹、张旺、周敏等人的研究探索[8-11]，试剂盒法操作简单，利于实验室应用与样品检验，且国标法中亦有提到试样提取液也可采用预先包埋了菌种的微生物法生物素试剂盒测定，效果相当[12]，故本次人员比对采用了试剂盒法进行试验。

生物素检测方法有多种，包括微生物法、色谱法、荧光法等，当前，生物素微生物检测法被美国AOAC和中国国家标准选定为仲裁方法，方法原理是利用植物乳杆菌对有活性生物素的特异性，从而检测出生物素[9]。在本文中基于微生物检测的原理，使用试剂盒法对2名检验员进行婴幼儿配方奶粉中生物素检测的人员比对，从比对结果可知两者测定的生物素的结果差异不显著，两者的测定结果均表明该奶粉中生物素的含量符合营养成分表(生物素含量>12.0μg/100g)。

本文在实验前进行了多次预实验，在预实验中发现一些问题：标准曲线线性关系不好(R2<0.99)；因估算不准，样品稀释倍数选取不正确，导致测出结果不在标准曲线范围内；个别微孔读取的样品浓度平行性差异较大。

通过对检测步骤加以分析总结，得出以下实验要点：该实验易受外界因素干扰，在操作中注意无菌的同时，实验中所使用到的器皿还须避免各种杂质的干扰，特别是玻璃器皿，在使用前应用2%的盐酸液浸泡数小时，洗净烘干后再使用；在样品处理时，注意稀释倍数的选取，若估算不准，应尝试多个稀释度，并注意稀释液的均匀性；在上板时因加样量大，要谨慎细致，加液体时沿孔壁加入，以防液体飞溅污染其它孔影响试验结果；读数前须将板内培养物充分混匀并保证读数时每孔的空气都排尽，保证结果的准确性。

综上所述，通过人员比对，可以分析总结在实验中易出现的问题，提高检验员的检测能力，从而提升实验室的检测水平。应定期开展内部人员比对进行质量控制，确保检验数据的准确性。并注意保存每次实验的样品信息和数据结果，为之后的测定提供参考，提高检测效率。