一株牛源致病性卡氏变形杆菌的分离鉴定与敏感药物筛选

马志宇，黄方园，王 巍，易 军，左之才，*

(1.四川农业大学 动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 雅安 625014； 2.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066)

卡氏变形杆菌(Proteuscibarius)是一种兼性厌氧、周生鞭毛的革兰氏阴性机会致病菌，属于肠杆菌科变形杆菌属。目前已发现变形杆菌属15个种，广泛存在于污水、土壤、粪便等自然环境，以及人和动物的消化道中[1-3]，是机体正常菌群的重要组成部分。在正常情况下，变形杆菌一般不引起人和动物发病，但当正常寄居部位发生改变或机体抵抗力下降时，可在体内大量生长繁殖，引起肺炎、尿道炎、肾盂肾炎等病症[4-6]；其中，以奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)和普通变形杆菌(Proteusvulgaris)最为常见。有报道称奇异变形杆菌是造成牛患病的主要病原之一，可使肉牛发生肠炎、肝炎、关节肿胀等病症[7-9]。陈星等[10]研究表明，普通变形杆菌可能是引起奶牛子宫内膜炎的重要原因。目前有关变形杆菌属其他菌种引起牛感染的报道仍较少。

卡氏变形杆菌是2016年Hyun等[11]在发酵海鲜中分离到的1株与食品污染有关的新型菌株。目前，大多数研究主要针对卡氏变形杆菌的多重耐药基因和对污染水源中重金属锑的吸附作用[12-13]，认为其不具有致病性。最近，Adesina等[14]报道，卡氏变形杆菌能感染人类，导致糖尿病患者创口复发感染。2019年7月，本研究首次从患有发热、咳嗽、流鼻液等呼吸系统症状的病牛鼻腔拭子分离到对小鼠有强致病性的卡氏变形杆菌，该菌可能为引起肉牛感染发病甚至死亡的主要致病菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

2019年7月，四川省宜宾市某牛场10余头肉牛陆续出现以体温升高、流涎、流鼻液、呼吸困难为主的呼吸道疾病，且有牛只死亡。无菌采集发病肉牛的鼻腔拭子，立即贮存在放有冰袋的保温箱中，带回实验室进行处理。

1.1.2 试验动物

12只(雌雄各半)4～5周龄、体重18～20 g的SPF级昆明小鼠购于成都达硕实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离纯化与群集运动特性测定

通过接种环划线将鼻腔拭子样品接种于胰蛋白胨大豆琼脂(tryptic soy agar，TSA)培养基上，在恒温箱中37 ℃倒置培养24 h后，观察菌落生长形态，选取单个优势菌落进行纯培养。将已纯化菌株接种到营养肉汤中37 ℃振荡培养18 h后，分别接种于琼脂浓度为1%、2%、3%的固体培养基中央，培养24 h后观察菌落生长迁徙情况与群集运动。纯化后的细菌加入无菌甘油，于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 生化特性鉴定

选取木糖、甘露醇、水杨素、丙二酸盐、赖氨酸脱羧酶、明胶等细菌生化微量反应管，参照生化管使用说明书和《常见细菌系统鉴定手册》[15]进行试验。

1.2.3 16S rRNA基因序列测定与系统发育分析

将纯化后的菌株接种于营养肉汤中，37 ℃培养24 h，用16S rRNA基因通用引物(上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 7 min；12 ℃保存。经琼脂糖凝胶电泳初步检测后，将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。采用Blast与Genbank已公布的10株变形杆菌(表1)的16S rRNA基因序列进行同源性分析，并构建系统进化树。

表1 GenBank公布的参考菌株信息

1.2.4 小鼠致病性试验与病理组织学观察

用接种环蘸取1环已纯化甘油保种的菌液接种于胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth，TSB)培养基中，37 ℃ 200 r·min-1恒温摇床培养12 h，随后用紫外分光光度计(Thermo公司)在600 nm波长下测定吸光度(D值)，通过换算得出培养后的菌液浓度为7.35×107CFU·mL-1。随机选取8只SPF级昆明小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，另取4只小鼠腹腔注射等量0.9% NaCl溶液作为对照，雌雄各半。每2 h观察1次，记录小鼠临床症状表现与死亡情况，及时对死亡小鼠进行剖检，观察各组织器官病变情况，并检测各器官细菌定植情况。无菌采集死亡小鼠的各脏器组织作切片观察病理学变化。

1.2.5 药敏试验

采用纸片扩散法(K-B琼脂法)对该分离菌进行耐药表型检测，将37 ℃恒温过夜培养的菌液浓度调整为0.5麦氏浊度，取100 μL菌液均匀涂布在MH琼脂培养基上，经过一段时间被完全吸收后分区域贴上药敏纸片，于37 ℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径，重复3次，取平均值。依据CLSI 2019标准对试验操作与结果进行判读。

2 结果与分析

2.1 菌株形态与生长特性

从样品中分离的优势菌株ZZC-JM-1在TSA培养基上纯化培养24 h后，形成边缘整齐、表面光滑、不透明的圆形菌落，且雾状薄膜布满整个培养基(图1-a)。挑取单个菌落染色镜检，细菌呈革兰氏阴性、单个或成对的短杆状(图1-b)。菌液接种在不同浓度琼脂培养基中央培养24 h，生长情况有明显差异，在1%和2%琼脂培养基上菌斑四周迁徙形成不规则的圆形雾状薄膜(图2-a和图2-b)，前者在相同时间内迁徙速度更快，范围更广；在3%琼脂培养基上则不表现群集运动(图2-c)。

2.2 生化鉴定结果

分离菌株ZZC-JM-1的葡萄糖、枸橼酸盐、木糖、丙二酸盐、蔗糖、苯丙氨酸、硫化氢、麦芽糖、明胶生化试验结果呈阳性，乳糖、甘露醇、吲哚试验结果呈阴性。除麦芽糖和蔗糖试验呈阳性外，其余生化结果与Adesina等[14]报道的卡氏变形杆菌一致(表2)。

表2 分离菌株ZZC-JM-1生化试验结果

2.3 16S rRNA序列鉴定与系统进化分析

凝胶电泳结果表明，扩增的菌液16S rRNA基因片段为1 500 bp(图3)。Blast分析结果表明，该菌株的16S rRNA基因与变形杆菌属细菌的16S rRNA基因同源性均高于98%，其中，与卡氏变形杆菌的同源性最高，达99.7%。系统进化树(图4)显示，分离菌株ZZC-JM-1的16S rRNA序列与来源于猪粪便的中国江苏株卡氏变形杆菌(CP047349.1)聚为一个分支，与奇异变形杆菌、普通变形杆菌和同属其他变形杆菌的遗传距离较远。

2.4 分离菌株ZZC-JM-1对小鼠的致病性

2.4.1 攻菌小鼠临床症状与剖检病变

8只小鼠攻菌后，2 h后开始出现被毛粗乱，眼角出现分泌物，5 h开始萎靡、寒颤，7～14 h攻毒的8只小鼠全部死亡；而对照组4只小鼠运动、饮食未见异常，经过一段时间全部存活。剖检可见攻菌组小鼠肺充血、呈鲜红色，肝肿大呈土黄色、表面有出血点，脾淤血肿大(图5)，心、肾、脑未见明显病变；而剖检对照组小鼠器官和脑未出现异常。取攻菌小鼠的心、肺、肝、脾、肾，用无菌接种环划线接种于普通琼脂平板上，37 ℃培养12 h后观察到心、肺、肝、脾、肾中均分离到与上述攻毒菌株菌落形态、生长特性相同的细菌，表明所分离细菌为致病性细菌，可导致小鼠多组织器官发生病变。

2.4.2 病理组织学观察

病理切片观察(苏木精—伊红染色法，400×)发现，攻菌小鼠肺充血，肺泡壁增厚并呈现以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润(图6-a)；肝中央静脉和肝窦淤血，肝索增宽，肝窦变窄，肝细胞变性坏死(图6-b)；脾淤血，髓质内出现大量红细胞，并有空泡变性(图6-c)。

2.5 药敏试验

在测定的20种常用抗生素中，分离菌株ZZC-JM-1对头孢类、青霉素类、碳青霉烯类、四环素类等17种抗菌药物耐药，仅对环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星高度敏感(表3)。

表3 分离菌株ZZC-JM-1药敏试验结果

3 结论与讨论

变形杆菌可感染动物并造成严重的经济损失。近几年来，以奇异变形杆菌和普通变形杆菌为主感染羊、鹅、猪等常见畜禽的报道比较多，主要以引起关节炎、肺炎、败血症等症状为主[16-18]。同时，也可以引起水生动物体表溃烂、穿孔病、白斑病等病症[19-20]。值得注意的是，它们可感染国家濒危保护动物，引起扬子鳄尿酸盐沉积与华南虎急性死亡[21-22]，造成严重物种威胁。卡氏变形杆菌可感染人类，引起伤口化脓等症状，也可感染动物。但尚未报道该菌引起动物发病，存在成为继发性感染细菌的可能性。本试验从患有呼吸道疾病的肉牛鼻腔中分离到卡氏变形杆菌，并证明其对小鼠具有较强的致病性，应引起高度重视。

卡氏变形杆菌兼具奇异变形杆菌所表现出的群集运动，本研究利用含不同琼脂浓度的普通培养基测定分离菌株的迁徙能力，结果表明，随琼脂浓度(1%、2%、3%)的升高，菌株迁徙能力减弱，与任梅渗等[23]报道的奇异变形杆菌的特性一致。除麦芽糖和蔗糖试验结果呈阳性外，分离菌株ZZC-JM-1的其他生化特性均与Adesina等[14]报道的人伤口源卡氏变形杆菌生化特性一致。

分离菌株对小鼠有较强的致死性，攻菌后2 h小鼠出现精神沉郁、运动迟缓等症状，7～14 h全部死亡，死亡小鼠的肺、肝、脾等器官出现充血、肿大。分离菌株ZZC-JM-1具有较强的耐药性，仅对喹诺酮类和氨基糖苷类的部分药物敏感，这是否与其可产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases， ESBLs)和携带floR耐药基因有关，尚有待进一步研究。在肉牛养殖过程中，通常会根据临床发病情况初步选用常规药物先进行治疗，牛场本病发生后立即选用动物专用的内酯类半合成抗生素泰拉霉素和加米霉素进行治疗，并有效控制住了病情。根据药敏试验结果，还可选用环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素等药物治疗。