基于HRM 方法检测乳腺癌组织TOX3,PPP2R1A,PTEN 基因突变

2021-11-03徐雯洁刘晓丽耿雪侠张海军

阜阳师范大学学报(自然科学版) 2021年2期

徐雯洁，张涵，张涛，刘晓丽，耿雪侠，张海军

（淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北 235000）

乳腺癌是发生于乳腺腺上皮组织的一种恶性肿瘤疾病，近年来在女性中发病率极高，居各类疾病首位。乳腺癌引起的死亡率也越来越高，居第四位，对全球女性的生命健康构成严重威胁[1]。虽然早期可通过手术进行治疗，但由于检测和诊断手段的不足，及对该病发生和转移机制的研究还不够深入，往往发现时已经发生了癌细胞转移，这是乳腺癌发病率和死亡率持续上升的重要原因，因此明晰乳腺癌发病和转移相关的基因，将有利于针对该病检测和诊断，以及治疗方法的研发[2]。

TNRC9 基因又称TOX3，位于染色体16q1.2，含3 个核苷酸重复基序和一个假定基因LOC643714，该基因可能与与乳腺癌的骨转移相关联[3]；另外，TOX3 蛋白在乳腺癌组织中的表达量较高[4]。与正常组织相比，乳腺癌组织中TOX3基因亚族发生甲基化的比例明显升高，而甲基化后的转录水平在很大程度上会降低，启动子区CpG 岛有该基因的甲基化区域[5]，推测TOX 基因的作用可能类似于抑癌基因，肿瘤的发生可能是由该基因的启动子发生了超甲基化导致了相关基因的沉默，但具体致癌机制尚未明确[6-7]。PPP2R1A 是PPP2A 结构亚基A，α 亚型，作为蛋白磷酸酶PP2A 的结构亚基，是细胞生长和增殖至关重要的正性调节蛋白，在PP2A 全酶催化过程中起着支架和联结的作用[8-10]，Calin GA 等[11]检测到PPP2R1A 在肺癌、乳腺癌及恶性黑素瘤中出现不同的突变体，对肿瘤发生和转移有抑制作用。PTEN 基因定位于人类染色体10q23.3，是一种具有磷酸酯酶活性的肿瘤抑制基因，能与多种信号通路相互作用，抑制肿瘤转移、促进细胞凋亡、调控细胞周期等[12]，已有研究发现PTEN 基因中存在突变或甲基化等遗传学改变。PTEN 基因的第5、8 外显子因其较高的突变率已成为众多相关实验中成为研究的热点区位[13-14]。有研究表明PTEN 基因外显子5、7、8 在前列腺癌、子宫内膜癌及晚期神经胶质瘤中突变率高达40%[15]。

HRM 系统是近年来用于检测DNA 片段单个碱基是否发生突变的一种新技术，具有检测时间短、特异性高、高通量、单管无污染、灵敏度高等特点，该方法可检测出单个碱基的差异[16-17]。选用HRM 系统分析基因突变位点，主要是通过DNA片段长短、碱基含量、碱基分布的差异，利用熔解曲线形状和高度位置的细微差距，检测基因是否发生突变[18]。

本实验通过HRM 法检测乳腺癌组织中PTEN 的5 号外显子、TOX3 的7 号外显子、PPP2R1A 的6 号外显子的基因突变情况，进一步结合基因测序技术进行验证，找出这3 个基因中可能与乳腺癌发生和转移相关的位点，为进一步快速筛选乳腺癌提供了有效且快速的方法。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

从青海某医院获得的具有完整病例且经过病理学确诊的36 例乳腺癌冷冻组织标本和1 例癌旁组织。

1.2 检测方法

1.2.1 基因组DNA 提取

通过Ezup 柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工生物公司）对乳腺癌样本组织进行基因组DNA 提取，通过超微量分光光度计测定DNA浓度及纯度。

1.2.2 引物设计

根据GenBank中上传的TOX3、PPP2R1、PTEN 等基因的SNP 序列，通过使用引物设计软件Primer Premier 设计特异性引物，由上海生工生物公司合成，序列如下表1。

表1 HRM 分析引物序列

通过常规PCR 扩增体系与琼脂糖凝胶电泳观察电泳条带分析结果，检测引物扩增效率及特异性。体系如下（10 μL）：DNA 模板（0.5 μL）、ddH2O（3.7 μL）、Forward 引物（0.4 μL）、Reverse 引物（0.4 μL）、2×Taq PCR Master Mix（5 μL）。PCR扩增程序为：预变性94 ℃，2 min；变性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s；40 个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 HRM 检测

按照下列比例配制HRM 扩增的PCR 反应体系（10 μL）为：RNase-Free ddH2O（6.5 μL）、2×HRM Analysis Premix（5 μL）、10 μM Forward 引物（0.3 μL）、10 μM Reverse 引物（0.3 μL）、DNA 模板（0.5 μL）。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 个循环。扩增结束后用Lightscanner 进行HRM 检测与分析。

1.4 测序验证

为了进一步说明基因的突变情况，根据HRM分析结果，选择不同突变类型的样品和癌旁组织样品通过PCR 扩增后，送扩增产物到上海生工生物公司进行测序分析。

2 结果与分析

2.1 基因组浓度和纯度测定

对乳腺癌组织和癌旁组织样本进行基因组提取，通过检测所有样本的DNA 浓度A260/A280均在1.8-2.0 之间，满足HRM 分析要求。

2.2 引物扩增特异性检测

针对TOX3 基因7 号外显子、PPP2R1A 基因6 号外显子、PTEN 基因5 号外显子设计的特异性引物合成后通过常规PCR 进行抽样检测，结果见图1，各引物扩增效果和特异性均较高，可用于HRM 分析。

图1 各引物扩增特异性和扩增结果检测电泳图。

2.3 高分辨率熔解曲线分析法结果及测序结果

通过高分辨率熔解曲线对待测的36 例乳腺癌组织和1 例癌旁组织样品进行分析，根据分析结果分别选择突变样本和癌旁组织进行测序。

TOX3 基因7 号外显子与PPP2RA1 基因6号外显子的高分辨率熔解曲线图均未发生突变（图2，图3）；测序结果显示TOX3 基因7 号外显子第1102 位核苷酸基因型为CC（图2c），与HRM结果一致；PPP2R1A 基因6 号号外显子1025 位核苷酸基因型均为CC（图3c）未发生基因突变，结果一致。说明TOX3 基因7 号外显子与PPP2R1A 基因5 号外显子不是乳腺癌的热点突变位置，可能与乳腺癌的发生无关或相关性较差。

图2 基因TOX3 外显子的高分辨率熔解曲线。

PTEN 基因5 号外显子的熔解曲线与差分曲线分析结果显示该基因在5 号外显子存在一种类型的突变体，如图4a、4b 所示；通过对突变样品和癌旁组织扩增后进行测序分析，结果显示PTEN 基因5 号外显子第1408 位核苷酸基因由A 突变为T（图4c），导致编码氨基酸由N 突变为Y。说明该基因的5 号外显子可能是PTEN 基因的热点突变区，乳腺癌的发生可能与其突变有一定的关系。

图4 基因PTEN 外显子的高分辨率熔解曲线

3 结论与讨论

乳腺癌在近几年发病率和致死率呈持续升高的走势[19]，在早期由于缺乏典型临床症状，乳腺癌容易被患者忽视，因此确诊时往往至中晚期，使得乳腺癌的致死率仍呈现不断上升趋势[20]。通常情况下，乳腺癌的发病是由环境要素和基因要素一起导致的。目前虽有对乳腺癌的检测方法，但乳腺癌的发病率仍在上升，探究乳腺癌的发病机制受到越来越多的关注。

虽然已有报道显示TOX3 基因属于高迁移率染色质非组蛋白家族，全基因组关联性研究（Genome-wild association study，GWAS）显示该为乳腺癌的易感基因中存在TOX3 基因[21]，但本研究通过HRM 分析结合DNA 测序结果发现，TOX3基因的7 号外显子无突变，其原因可能是实验所用乳腺癌样本量过少，不能完全筛出突变体，也可能说明该基因与乳腺癌发生和转移的相关性不高，进一步确认仍需大量样本进行进一步检测；PPP2R1A 基因被发现在上皮性卵巢中高频突变，且有研究检测在肺癌、结肠癌、子宫浆液性肿瘤等恶性肿瘤中基因突变，其可能与恶性肿瘤的发生有关[22]。但本研究通过HRM 分析和测序针对突变热点PPP2R1A 基因6 号外显子进行检测，结果均未检测到突变体，推测该基因的6 号外显子与乳腺癌发生和转移相关性较低或不相关，或因样本数量太少未检测出突变体。

PTEN 基因是1997 年在染色体10q 发现的具有双特异性的一个抑癌基因，其在乳腺癌中的突变率较高，但在侵袭性高的乳腺癌细胞系中低表达。本研究通过对PTEN 基因5 号外显子的HRM 分析和DNA 测序分析发现，有11 例发生杂合突变，编码序列的1408 位点核苷酸由A 突变成T，导致其编码氨基酸由N 突变为Y。推测PTEN基因核苷酸序列的突变，或者核苷酸突变所引起的相应氨基酸的改变，可能与乳腺癌的发生和转移相关。有研究报道PTEN 基因的错义突变常发生在外显子5 和6 上[23]，多为错义突变，常发生于原发性乳腺癌中。PTEN 基因碱基突变可能位于5 号外显子的磷酸酯合成酶的核心序列处，导致双磷酸酶失活不能使体内的酪氨酸残基去磷酸化从而导致细胞过度增殖与肿瘤恶性转移；也有可能是PTEN 基因突变使得其编码的氨基酸改变，蛋白表达降低影响PI3K/ PTEN/PKB/Akt 信号转导途径功能进而影响乳腺癌细胞的生长。在乳腺癌中PTEN 的点突变不如杂合性缺失概率高，后续实验将进一步完善这方面的研究，以及检测到突变位点如何控制调控乳腺癌的发生与发展。本研究所获的结果有助于进一步了解乳腺癌的发生机制，也为乳腺癌的生理早期预测所获得与定点治疗提供理论依据。