紫草素对宫颈癌细胞株Caski 侵袭迁移及Wnt/β-catenin 信号通路的影响

刘丛丽，董金菊，周双玉

1 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院西区妇产科，湖北 襄阳441000；2 南漳县妇女儿童医院妇产科

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，随着Pap 涂片技术的推广，宫颈癌的发生率和死亡率明显降低，但是其全球病死率依然仅次于乳腺癌，居女性肿瘤第二位，而且近年来发病有年轻化趋势［1-3］。现代医学研究发现宫颈癌的发生是一个多步骤、多因素发展过程，包括抑癌基因的缺失失活、原癌基因的表达、细胞周期蛋白调节的异常、端粒及端粒酶功能异常等多种因素［4-5］。临床治疗以手术、化疗、放疗或新辅助化疗为主，易造成机体免疫功能下降，甚至出现并发症而导致死亡。因此，寻找低毒、高效、专一的抗宫颈癌药物为该疾病相关研究之一。

紫草素（shikonin）是从紫草科植物紫草的根中提取的一种有效成分，其化学结构为萘醌类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等作用［6］。目前，其表现出很好的抗肿瘤特性，对乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等都有抑制癌细胞增殖的作用［7-9］，但对宫颈癌细胞的增殖、侵袭迁移及信号通路方面的研究较少。

本研究探讨紫草素对人宫颈癌细胞Caski 侵袭迁移及Wnt/β-catenin信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞Caski 细胞购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞用含10% 胎牛血清的高糖型DMEM 培养基培养于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞融合度达到80%时以1∶3传代。

1.2 实验试剂MTT（IM0280，Solarbio，中国）；DMSO（D8372，Solarbio，中 国）；Transwell 小 室（MCHT24H48，Millipore，美国）；Matrigel 基质胶（356234，BD，美国）；DMEM 高糖培养基（11965084，Hyclone，美国）；FBS（10099141，Hyclone，美国）；RIPA 裂解液（P0013B，Beyotime，中国江苏）；SDSPAGE凝胶试剂盒（P0012A，Beyotime，中国江苏）；Trizol（9109，Takara，日 本）；逆 转 录 试 剂 盒（RR047A，Takara，日本）；实时定量PCR 试剂盒（RR820L，Takara，日本）；兔抗β-Catenin 单克隆抗体（ab52372，Abcam，英国）；兔抗p-β-Catenin单克隆抗体（ab27798，Abcam，英国）；山羊抗兔二抗（A0208，Beyotime，中国江苏）。

引物GSK-3β：5′-CACCTCTGGCTACCATCCTTAT-3′；5′-ATTATTGGTCTGTCCACGGTCT-3′；Wnt2B：5′-GTGTCCTGGCTGGTTCCTTA-3′；5′-AGCTGGTGCAAAGGAAAGAA-3′。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT 细胞增殖实验 取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，计数后配制成1.5×105/mL悬液，以每孔100 加入到96 孔板中，37℃、5%CO2细胞培养箱培养24 h 后，以每孔0、2、4、8、16 μg/mL 的浓度加入紫草素，每组设6 个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，分别处理24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），继续培养4 h 后，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO溶解MTT，于490 nm处检测OD值，计算抑制率。

1.3.2 细胞侵袭实验 将Transwell 小室放入24孔板，4℃预冷后，上室加入1∶4稀释的Matrigel基质胶，待凝固后上室加入无血清培养基配制的细胞悬液400 μL，细胞数为1.5×105个，下室加入20% FBS 培养基，待细胞沉降后上室每孔加入一定浓度紫草素，每组设6 个平行孔，加入相同体积溶媒作为空白对照，处理24 h 后，取出小室，PBS漂洗后-20℃预冷甲醇固定5 min，用棉签轻轻拭去上室未迁移细胞，结晶紫染色5 min，PBS 漂洗，拍照，计数。

1.3.3 细胞迁移实验 将Transwell 小室放入24 孔板，上室加入无血清培养基配制的细胞悬液400 μL，下室加入20% FBS 培养基，待细胞沉降后上室每孔加入一定浓度的紫草素，每组设6 个平行孔，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h后，取出小室，PBS漂洗后-20℃预冷甲醇固定5 min，用棉签轻轻拭去上室未迁移的细胞，结晶紫染色5 min，PBS漂洗，拍照，计数。

1.3.4 qPCR 实验 取对数生长期细胞，加入合适终浓度紫草素，加入相同体积溶媒作为空白对照，处理24 h 后，加入1.5 mL Trizol 于冰上吹打细胞，室温静置5 min，13 000 rpm离心5 min，吸取上清液，加入氯仿，静置离心，吸取上清液加入异丙醇，静置离心，弃去上清液，75% 乙醇清洗沉淀，离心弃上清，保留沉淀干燥，用DEPC 水溶解。然后按照Takara 反应试剂盒依次经过去除基因组DNA反应、反转录反应和RT-PCR进行扩增，扩增程序为：预变性：95℃、10 min、1循环数；扩增：95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、30 s、40循环数。

1.3.5 Western bloting 实验 取对数生长期细胞，加入合适终浓度紫草素，加入相同体积的溶媒作为空白对照，处理24 h后，加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至匀浆后，4℃放置30 min，13 000 rpm离心10 min，取一部分上清液，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，另一部分上清液加入4×上样缓冲液，煮沸变性后加到4%浓缩胶浓缩，10%分离胶分离，经过转膜、封闭、4℃孵育一抗、室温孵育二抗、ECL 发光液显色、X医用胶片显影、定影等，最后拍照分析。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0 统计软件分析数据，计量资料以xˉ±s表示；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对Caski 细胞增殖的抑制作用对照组Caski 细胞生长活跃，经不同浓度（2、4、8、16 μg/mL）紫草素处理后，细胞生长呈现不同的抑制作用。在同一时间下，随着紫草素浓度的升高，其对Caski 细胞增殖抑制率越大，相同浓度下，对Caski 细胞作用时间越长，抑制率越大，因此，紫草素对Caski 细胞增殖抑制作用具有时间-浓度依赖性。见表1。

表1 紫草素对Caski细胞增殖的抑制作用（xˉ± s）

2.2 紫草素对侵袭Caski 细胞的抑制作用随紫草素浓度的升高，Caski 细胞侵袭数目越少，与空白对照组相比，2 μg/mL紫草素差异显著（P＜0.05），4、8、16 μg/mL 紫草素差异极显著（P＜0.01）。见图1。

图1 紫草素对Caski细胞侵袭的影响

2.3 紫草素对Caski 细胞迁移的抑制作用随紫草素浓度的升高，Caski细胞迁移数量越少，与空白对照组比较，2 μg/mL处理组差异显著（P＜0.05），4、8、16 μg/mL 紫草素差异极显著（P＜0.01）。见图2。

图2 紫草素对Caski细胞迁移的影响

2.4 紫草素对Caski 细胞GSK-3β、Wnt mRNA 表达的促进作用与空白对照组相比，随着紫草素浓度的升高，Caski 细胞内GSK-3βmRNA 含量逐渐升高，Wnt mRNA含量逐渐减少（P＜0.01）。见图3。

图3 各组细胞GSK-3β、Wnt mRNA表达量变化情况

2.5 紫 草 素 对Caski 细 胞β -Catenin、p- β -Catenin 的影响随着紫草素处理浓度的升高，Caski 细胞内β-Catenin 蛋白越少，p-β-Catenin蛋白越多，其中与空白对照组相比，8、16 μg/mL紫草素差异显著（P＜0.01）。见图4。

图4 各组细胞β-Catenin、p-β-Catenin蛋白变化情况

3 讨论

紫草素已在白血病、肝癌、胃癌、乳腺癌等癌症方面表现出良好的抗癌作用［10-14］。但紫草素对宫颈癌的抗癌能力方面研究报道较少，本研究发现紫草素可浓度-时间依赖性抑制人宫颈癌细胞系Caski细胞的增殖。

癌症发生侵袭迁移是癌症恶化的标志，抑制癌症的侵袭迁移对预防癌症恶化具有重要意义。本研究发现紫草素可有效抑制Caski 细胞的侵袭迁移，并表现出一定剂量依赖性。Wnt是Wnt信号通路的胞外信号，与Wnt 受体结合可激活该通路，本研究发现紫草素可抑制Caski细胞Wnt mRNA表达，因此，紫草素首先通过抑制Wnt分泌使Caski细胞Wnt 信号通路处于低活性状态。Wnt 信号通路的调节关键在于胞内β-Catenin 的稳定与含量，当β-Catenin 水平低下时，Wnt 通路关闭；反之，Wnt通路开启。而维持β-Catenin 稳定的关键蛋白是GSK-3β，在无Wnt 信号刺激情况下，胞质内GSK-3β能与其他蛋白例如APC、Axin 等以复合物形式磷酸化β-Catenin 氨基末端Ser/Thr 位点，使β-Catenin 泛素化降解，维持细胞内β-Catenin 低水平状态。在Wnt 信号刺激情况下，由细胞分泌的Wnt蛋白与细胞表面受体FZD和LRP5/6结合后触发细胞内信号转导：细胞内蛋白Dsh（dishevelled）被活化，活化的Dsh 与Axin 及Frat1 结合，后两者与GSK-3β和APC 基 因 形 成 复 合 物，Frat1 介 导GSK-3β从Axin脱离，不能磷酸化β-Catenin，导致β-Catenin 水平升高并激活下游转录因子，促进转移相关因子高表达，进而促进肿瘤转移［15］。本研究发现紫草素可诱导Caski 细胞内GSK-3βmRNA 表达。随着Caski 细胞内GSK-3β表达量的增多，其与更多的β-Catenin 结合，打破胞内β-Catenin 磷酸化平衡反应，使更多β-Catenin 磷酸化降解，而且随着紫草素浓度的增高，Caski 细胞内β-Catenin 含量越少，p-β-Catenin 含量越多。大量β-Catenin 被紫草素诱导降解，导致β-Catenin 在细胞内积累受阻，抑制β-Catenin 转移到细胞核与转录因子TCF 相结合，进一步抑制靶基因如VEGF、基质金属蛋白酶等侵袭迁移相关因子的表达激活。

综上所述，紫草素可通过促进Caski 细胞Wnt/β-Catenin 通路中GSK-3βmRNA 表达和p-β-Catenin 蛋白表达，抑制Wnt mRNA 表达和β-Catenin 蛋白表达，从而抑制Caski 细胞的侵袭迁移。