箭叶淫羊藿中具有HDAC抑制活性的化学成分研究

胡阳亮，黎 欢,3，姬贵梅，沈小玲，魏孝义，符林春，胡英杰*

1广州中医药大学科技创新中心，广州 510405；2中国科学院华南植物园，广州 510650；广州中医药大学岭南医学研究中心，广州 510405

在真核细胞内，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)通过移除核心组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基使组蛋白恢复正电性，从而与带负电荷的DNA紧密结合形成结构致密的染色质，抑制特定基因的转录。HDACs异常活化和肿瘤发生、组织发育异常等疾病密切相关。已有开发的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)应用于临床。例如，伏立诺他(SAHA)和Romidpesin已成为皮肤和外周淋巴细胞瘤治疗药物[1-3]。HDAC抑制剂结构各异，既有短链脂肪酸类的丁酸、曲古菌素A(trichostatin A)，环肽类的romidepsin，也包括黄酮类的染料木素、山奈酚，是新药发现的一个热点[4,5]。淫羊藿是一种补肾健骨中药，有强肌健骨、抗风湿、增进肝肾等功效[6]；药理研究揭示了淫羊藿药材在增强性功能、调节激素、调节免疫、防治骨质疏松症等方面的作用[7,8]。淫羊藿药材含有140余种不同类型的黄酮类成分[9-11]，但罕有基于HDAC抑制机制研究淫羊藿抗骨质疏松活性成分的研究报道[4,9]。本文报道我们在活性示踪指导下对箭叶淫羊藿HDAC抑制活性成分筛选和鉴定的结果。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

中药对照品：淫羊藿苷(批号110737-200415)和山奈酚(批号110861-200405)(中国药品生物制品鉴定所)。植物样品：采于四川省绵阳，由广州中医药大学胡英杰研究员鉴定为箭叶淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.Et Zucc.)Maxim，标本存于广州中医药大学科技创新中心中药新药发现实验室，编号YYH No.15)。色谱材料：GF254薄层(10～40 μm)硅胶预制板、柱层析硅胶(200～300目)(青岛海洋化工厂)；D101大孔吸附树脂(河北沧州树脂厂)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(50 μm)(美国GE Healthcare公司)；色谱纯溶剂(美国默克公司)；分析纯溶剂(国产)。TLC显色剂：6%香草醛乙醇溶液与12%高氯酸水溶液等体积混匀后喷雾、加热。生物活性分析材料：HDAC抑制剂筛选试剂盒(货号K340-100)、HDAC1、HDAC2和HDAC11一抗(美国Biovision公司)；RIPA裂解缓冲液和BCA蛋白分析试剂盒(上海碧云天)；CCK-8细胞计数试剂盒(日本同仁化学)，RPMI 1640培养基(以色列BI公司)。南美来源小牛血清(美国Gibco公司)；HDAC3～10、辣根过氧化物酶-缀合二抗(羊抗兔或鼠IgG H&L)(美国Abcam公司)；GAPDH和β-actin的一抗(北京中山金桥生物科技公司)。

1.2 主要仪器

DRX-400核磁共振仪(德国布鲁克公司)，C506-Triple TOF 5600 System质谱仪(美国AB SCIEX公司)，LC6000制备HPLC仪(北京创新通恒科技公司)和配置DAD检测器与Phenomenex ODS柱(Luna，250 mm × 4.6 mm，5 μm)的1260HPLC仪(美国安捷伦公司)，C-DiGit化学发光成像仪和BioTek的Synergy HT多功能酶标仪(美国Li-Cor公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 提取与成分分离

箭叶淫羊藿叶干燥粗粉(2.0 kg)用70%乙醇回流提取3次，提取液减压蒸除溶剂得醇提物稠膏。将稠膏加水悬浮，依次用石油醚(PE)、二氯甲烷(CH2Cl2)、乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)充分萃取，萃取液减压蒸干得各溶剂部位：14.8 g(PE)、21.6 g(CH2Cl2)、25.4 g(EtOAc)和76.4 g(n-BuOH)。取EtOAc部位(17.4 g)经D101大孔吸附树脂柱吸附，以含乙醇0、20%、40%、60%、80%和95%(V/V)的水溶液依次洗脱，得水洗脱部位1.16 g，20%、40%、60%、80%和95%乙醇洗脱部位1.75、5.57、4.68、0.94和1.11 g。取60%乙醇洗脱部位4.6 g进行柱层析分离纯化：依次经过200～300 目硅胶柱层析、氯仿-甲醇(95∶5→7∶3)洗脱；C-18烷化硅胶反相层析、甲醇-水(5∶5→8∶2)洗脱；制备高效液相色谱柱层析、乙腈-水-甲酸(20∶80∶0.1→30∶70∶0.1)洗脱；以及Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析、甲醇洗脱，获得化合物1(9.8 mg)、3(4.0 mg)、4(5.1 mg)、5(40.6 mg)、6(6.4 mg)、7(5.1 mg)、8(5.2 mg)、9(8.2 mg)和10(4.3 mg)。40%乙醇洗脱物5.5 g依次进行C-18烷化硅胶反相层析、甲醇-水(3∶7→7∶3)洗脱，以及Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析、甲醇洗脱，获得化合物11(5 mg)和2(6.1 mg)。

1.3.2 HDAC酶抑制活性的筛选评价

将待测试样品溶于DMSO制成储备液(储备液浓度：提取物，20 mg/mL；化合物，20 mM)，于-20 ℃保存备用。PE和CH2Cl2部位不溶于DMSO，未进行HDAC活性实验。活性测定时，取储备液加超纯水稀释至设定浓度，用HDAC抑制剂药物筛选试剂盒按手册说明操作进行测定[12]。基本原理：试剂盒所含HDAC底物有一条乙酰化赖氨酸侧链，当其被HDAC去乙酰后，赖氨酸侧链与赖氨酸显色剂反应产生荧光团而被检测到；用检测的荧光强度反映HDAC的酶活性，而HDACi可抑制去乙酰化反应产生的荧光。实验以试剂盒提供的曲古霉素A为HDACi阳性对照，每个测试药物浓度设置两个复孔。70%乙醇提取物设定工作浓度为1.0、0.5和0.25 mg/mL；EtOAc或n-BuOH部位设定工作浓度为400、200和100 μg/mL。分别检测对HDAC活性的抑制率。

1.3.3 活性部位分离得到的化合物对宫颈癌HeLa细胞活力的影响

1.3.4 活性部位分离得到的化合物对HeLa细胞表达HDAC的影响

将10 mL密度为5 × 104细胞/mL的HeLa细胞悬液置于10 cm培养皿培养24 h，使贴壁。更换培养液为含有不同浓度测试样品的新鲜培养液，继续培养24 h。收集细胞，加入RIPA 裂解缓冲液使细胞裂解，提取总蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒定量。取30 μg蛋白样品进行10% SDS-PAGE 凝胶电泳，100V下移至PVDF膜。PVDF膜用5%脱脂奶粉封膜后，加5%脱脂奶粉-TBST稀释的一抗(稀释倍数见表1)，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，加3%脱脂奶 TBST稀释的二抗(稀释倍数见表1)，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜3次，C-DiGit化学发光成像仪记录图像。

表1 抗体稀释倍数Table 1 Dilution ratios for the antibody

2 实验结果

2.1 箭叶淫羊藿70%乙醇提取物及其溶剂部位的HDAC抑制活性

用HDAC抑制剂筛选试剂盒测试了箭叶淫羊藿70%乙醇提取物对HDAC活性的抑制效果，发现其在0.25～1.0 mg/mL工作浓度时对HDAC活性的抑制率为36.0%～73.9%，抑制作用具有剂量依赖性(见表2)。为了进一步富集其活性成分，将70%乙醇提取物分成了不同的溶剂提取部位。其中，EtOAC部位和n-BuOH部位的水溶性相对较好，可采用HDAC 抑制剂筛选试剂盒进行HDAC抑制活性评价。评价结果显示，EtOAc部位在100～400 μg/mL工作浓度下对HDAC活性的抑制率是24.3%～58.9%，抑制效果强于相同浓度的n-BuOH部位(抑制率18.5%～42.0%)(见图1A)，因此选择EtOAc部位做进一步活性成分富集。EtOAc部位经D101大孔树脂柱处理得到不同浓度的乙醇洗脱物。测试了这些洗脱物对HDAC活性的抑制率，结果见图1B。在50～200 μg/mL浓度下，40%和60%乙醇洗脱物的HDAC抑制率为15%～34%，高于80%和20%乙醇洗脱物的抑制率(15%～22%)；水和95%EtOH洗脱物对HDAC无活性。因此，选取大孔树脂40%和60%乙醇洗脱物作为富含HDAC抑制活性成分的有效部位并进行活性成分鉴定和评价。

表2 箭叶淫羊藿70%乙醇提取物(EE-70)对HDAC活性的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of the 70% ethanol extract of E.sagittatum (EE-70) on HDAC activity

图1 箭叶淫羊藿提取物不同溶剂萃取部位(A)、EtOAc萃取部位的D101柱不同洗脱物(B)对HDAC活性的抑制作用Fig.1 HDAC Inhibitory effects of different solvent fractions of 70% ethanol extract of E.sagittatum (A) and the solvent eluates from D101 column of the EtOAc fraction (B)

2.2 从HDAC-抑制活性部位分离到的单体成分的鉴定

化合物1～10皆为黄色粉末，盐酸-镁粉反应均呈阳性，推测为黄酮类化合物。将它们的NMR和MS数据与文献数据进行对比分析，分别鉴定为：槲皮素(1)、牡荆苷(2)、山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(3)、山奈酚-3-O-β-D-木吡喃糖苷(4)、山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(5)、山奈酚-3-O-(6″-O-乙酰)-β-D-葡萄吡喃糖苷(6)、山奈酚-3-O-(6″-O-(E)-对-香豆酰基)-β-D-葡萄吡喃糖苷(7)、山奈酚-3-O-(2″，4″-双-O-(E)-对-香豆酰基)-β-D-葡萄吡喃糖苷(8)、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(9)和异鼠李素-3-O-β-D-木吡喃糖苷(10)。

化合物1TLC斑点的显色和Rf值与槲皮素对照品相一致；ESI-MS：m/z303.7 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.50(1H，s，5-OH)，7.67(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.54(1H，dd，J= 8.6，2.0 Hz，H-6′)，6.88(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5′)，6.40(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：175.8(C-4)，163.9(C-7)，160.7(C-5)，156.1(C-9)，147.9(C-3′)，146.7(C-2)，145.0(C-4′)，135.7(C-3，-5′)，121.9(C-1′)，115.6(C-6′)，115.0(C-2′)，102.9(C-10)，98.2(C-6)，93.3(C-8)。以上数据和文献[14]报道一致，故鉴定为槲皮素。

化合物2根据ESI-MS：m/z455.1 [M+Na]+、433.5 [M+H]+、431.2 [M-H]-，以及NMR数据推导出分子式为C21H20O10；结合不饱和度为12推测该化合物为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：13.18 (1H，s，5-OH)，8.03(2H，d，J= 8.3 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J= 8.3 Hz，H-3′，5′)，6.78 (1H，s，H-3)，6.27(1H，s，H-6)，4.68(1H，d，J= 9.0 Hz，H-1″)，3.84(1H，t，J= 9.0 Hz，H-2″)，3.70(2H，m，H-6″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：181.9(C-4)，163.7(C-2)，162.7(C-7)，161.0(C-5)，160.2(C-4′)，155.8(C-9)，128.8(C-2′，6′)，121.4(C-1′)，115.6(C-3′，5′)，104.4(C-8)，103.7(C-10)，102.2(C-3)，98.0(C-6)，81.7(C-5″)，78.5(C-2″)，73.2(C-1″)，70.7(C-3″)，70.3(C-4″)，61.1(C-6″)。以上数据和文献[15]报道一致，故鉴定为牡荆苷。

化合物3根据ESI-MS：m/z441.4 [M+Na]+、457.1 [M+K]+、859.3 [2M+Na]+、417.0 [M-H]-，以及NMR数据推导分子式为C20H18O10；结合不饱和度为12推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.55(1H，s，5-OH)，8.03(2H，d，J= 8.6 Hz，H-2′，6′)，6.87(2H，d，J= 8.6 Hz，H-3′，H-5′)，6.26(1H，br s，H-8)，6.04(1H，br s，H-6)，5.30(1H，d，J= 5.1 Hz，H-1″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：176.8(C-4)，168.4(C-7)，161.2(C-5)，160.4(C-4′)，156.7(C-9)，155.3(C-2)，133.2(C-3)，130.7(C-2′，6′)，120.6(C-1′)，115.3(C-3′，5′)，102.4(C-10)，101.4(C-1″)，99.9(C-6)，93.9(C-8)，71.7(C-2″)，70.8(C-3″)，66.1(C-4″)，64.3(C-5″)。以上数据和文献[16]报道一致，故鉴定为山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

化合物4根据ESI-MS：m/z441.5 [M+Na]+、457.3 [M+K]+、859.3 [2M+Na]+、417.5 [M-H]-，以及NMR数据推导分子式为C20H18O10；结合不饱和度为12推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.59(1H，s，5-OH)，8.03(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2′，6′)，6.90(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3′，5′)，6.44(1H，br s，H-8)，6.20(1H，br s，H-6)，5.34(1H，d，J= 7.0 Hz，H-1″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.3(C-4)，164.7(C-7)，161.2(C-5)，160.1(C-4′)，156.4(C-9)，156.1(C-2)，133.2(C-3)，130.8(C-2′，6′)，120.7(C-1′),115.3(C-3′，5′)，103.8(C-10)，101.7(C-1″)，98.8(C-6)，93.7(C-8)，75.8(C-3″)，73.7(C-2″)，69.4(C-4″)，65.9(C-5″)。以上数据和文献[17]报道一致，故鉴定为山奈酚-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物5根据ESI-MS：m/z471.2 [M+Na]+、487.2 [M+K]+、447.1 [M-H]-，以及NMR数据推导分子式为C21H20O11；结合不饱和度为12推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.6(1H，s，5-OH)，8.02(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J= 9.0 Hz，H-3′，5′)，6.43(1H，d，J= 2.0 Hz， H-8)，6.20(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，5.47(1H，d，J= 7.0 Hz，H-1″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.5(C-4)，164.6(C-7)，161.2(C-5)，160.0(C-4′)，156.4(C-2)，156.2(C-9)，133.1(C-3)，130.9(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，115.2(C-3′，-5′)，103.9(C-10)，100.9(C-1″)，98.8(C-6)，93.7(C-8)，77.5(C-5″)，76.4(C-3″)，74.2(C-2″)，69.9(C-4″)，60.8(C-6″)。以上数据和文献[18,19]报道一致，故鉴定为山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物6根据ESI-MS：m/z513.2 [M+Na]+、529.4 [M+K]+、489.5 [M-H]-，以及NMR数据推导出分子式为C23H22O12；结合不饱和度为13推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.59(1H，s，5-OH)，8.00(1H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，6.87(1H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.42(1H，br s，H-8)，6.19(1H，br s，H-6)，5.36(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1″)，4.10(1H，d，J= 11.0 Hz，Ha-6″)，3.95(1H，dd，J= 11.0，5.9 Hz，Hb-6″)，2.09(3H，s，CH3CO)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.2(C-4)，169.8(CH3CO)，165.3(C-7)，161.1(C-5)，160.1(C-4′)，156.5(C-2，9)，133.0(C-3)，130.8(C-2′，6′)，120.7(C-1′)，115.1(C-3′，5′)，103.5(C-10)，101.2(C-1″)，99.0(C-6)，93.8(C-8)，76.1(C-3″)，74.1(C-2″)，73.9(C-5″)，69.8(C-4″)，62.8(C-6″)，20.1(CH3CO)。以上数据和文献[18,20]报道一致，故鉴定为的山奈酚-3-O-(6″-O-乙酰)-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物7根据ESI-MS：m/z593.6 [M-H]-以及NMR数据推导出分子式为 C30H26O13；结合不饱和度为18推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.57(1H，s，5-OH)，7.99(1H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，7.37(1H，d，J= 8.3 Hz，H-2‴，6‴)，7.32(1H，d，J= 15.9 Hz，H-7‴)，6.86(1H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.79(1H，d，J= 8.3 Hz，H-3‴，5‴)，6.37(1H，br s，H-8)，6.12(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8‴)，6.10(1H，br s，H-6)，5.45(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1″)，4.27(1H，d，J= 12.0 Hz，Ha-6″)，4.03(1H，dd，J= 12.0，6.3 Hz，Hb-6″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.3(C-4)，166.2(C-9‴)，164.8(C-7)，161.1(C-5)，160.0(C-4′)，159.9(C-4‴)，156.4(C-2)，156.3(C-9)，144.6(C-7‴)，133.0(C-3)，130.8(C-2′，6′)，130.2(C-2‴，6‴)，124.9(C-1‴)，120.7(C-1′)，115.8(C-3‴，5‴)，115.1(C-3′，5′)，113.6(C-8‴)，103.6(C-10)，101.0(C-1″)，99.0(C-6)，93.7(C-8)，76.2(C-3″)，74.2(C-2″)，74.1(C-5″)，69.9(C-4″)，63.0(C-6″)。以上数据和文献[19]报道一致，故鉴定为山奈酚-3-O-(6″-O-(E)-对-香豆酰基)-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物8根据ESI-MS：m/z763.4 [M+Na]+、779.3 [M+K]+、739.5 [M-H]-，以及NMR数据推导出分子式为C39H32O15；结合不饱和度为24推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.58(1H，s，5-OH)，7.97(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2′，6′)，7.62(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7′′′′)，7.39(4H，d，J= 8.4 H，H-2‴，6‴，2′′′′，6′′′′)，7.36(1H，d，J= 16.0 Hz，H-7‴)，6.86(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，5′)，6.80(4H，d，J= 8.4 Hz，H-3‴，5‴，3′′′′，5′′′′)，6.44(1H，d，J= 16.0 Hz，H-8″″)，6.37(1H，d，J= 1.9 Hz，H-8)，6.15(1H，d，J= 16.0 Hz，H-8‴)，6.13(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6)，5.73(1H，d，J= 8.8 Hz，H-1″)，5.51(1H，t，J= 5.5 Hz，H-4″)，4.92(1H，t，J= 8.8 Hz，H-2″)，4.30(1H，d，J= 12.0 Hz，Ha-6″)，4.05(1H，dd，J= 12.0，6.2 Hz，Hb-6″)，3.57(1H，m，H-3″)，3.53(1H，m，H-5″)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.1(C-4)，166.1、165.8(C-9‴，9′′′′)，164.1(C-7)，161.0(C-5)，160.0(C-4′)，159.8(C-4‴，4′′′′)，156.4(C-2)，156.3(C-9)，145.1、144.7(C-7‴，7′′′′)，132.5(C-3)，130.3、130.2(C-2′，6′，2‴，6‴，2′′′′，6′′′′)，125.1、124.9(C-1‴，1′′′′)，120.6(C-1′)，115.7(C-3′，5′)，115.1(C-3‴，5‴，3′′′′，5′′′′)，114.2、113.6(C-8‴，8′′′′)，103.8(C-10)，98.7(C-1″)，98.2(C-6)，93.6(C-8)，74.3(C-3″)，73.8(C-2″，4″)，70.1(C-5″)，62.7(C-6″)。以上数据和文献[21]报道一致，故鉴定为山奈酚-3-O-(2″，4″-双-O-(E)-对-香豆酰基)-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物9根据ESI-MS：m/z501.2 [M+Na]+、517.2 [M+K]+、477.0 [M-H]-，以及NMR数据推导出分子式为C22H22O12；结合不饱和度为12推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.6(1H，s，5-OH)，7.95(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′)，7.48(1H，dd，J= 8.4，1.5 Hz，H-6′)，6.91(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.40(1H，br s，H-8)，6.18(1H，br s，H-6)，5.57(1H，d，J= 7.1 Hz，H-1″)，3.84(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.3(C-4)，165.1(C-7)，161.2(C-5)，156.5(C-9)，156.1(C-2)，149.4(C-4′)，146.9(C-3′)，132.9(C-3)，122.0(C-6′)，121.1(C-1′)，115.2(C-5′)，113.5(C-2′)，103.7(C-10)，100.8(C-1″)，99.0(C-6)，93.9(C-8)，77.5(C-5″)，76.4(C-3″)，74.4(C-2″)，69.8(C-4″)，60.6(C-6″)，55.7(OCH3)。以上数据和文献[18,20]报道一致，故鉴定为异鼠李素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。

化合物10根据ESI-MS：m/z471.2 [M+Na]+、487.5 [M+K]+、477.0 [M-H]-，以及NMR数据推导出分子式为C21H20O11；结合不饱和度为12推测其为黄酮苷；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.5(1H，s，5-OH)，7.86(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，7.54(1H，dd，J= 8.4，1.8 Hz，H-6′)，6.91(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.34(1H，br s，H-8)，6.11(1H，br s，H-6)，5.36(1H，d，J= 7.1 Hz，H-1″)，3.83(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：177.2(C-4)，165.1(C-7)，161.1(C-5)，156.4(C-9)，156.0(C-2)，149.6(C-4′)，147.0(C-3′)，132.9(C-3)，122.2(C-6′)，120.9(C-1′)，115.3(C-5′)，113.1(C-2′)，103.6(C-10)，101.8(C-1″)，99.0(C-6)，93.9(C-8)，76.0(C-3″)，74.0(C-2″)，69.5(C-4″)，66.0(C-5″)，55.6(OCH3)。以上数据和文献[22]报道一致，故鉴定为异鼠李素-3-O-β-D-木吡喃糖苷。

化合物11为白色粉末；根据ESI-MS：m/z515.3 [M+Na]+、531.3 [M+K]+和491.3 [M-H]-，以及NMR数据推测分子式为C25H32O10；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：1.69(1H，m，H-8′)，1.88(1H，m，H-8)，2.72(2H，m，H-7)，2.99(1H，m，H-7′)，3.71(6H，s，OCH3× 2)，3.91(1H，d，J= 8.0 Hz，Ha-9′)，4.02(1H，d，J= 8 Hz，H-1″)，6.07(1H，s，H-5)，6.47(1H，dd，J= 8.0，1.6 Hz，H-6′)，6.60(1H，s，H-2)，6.69(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.80(1H，d，J= 1.6 Hz，H-2′)，4.42、4.99、4.99、5.25、8.76和8.45(各1H，br s，OH × 6)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：145.5(C-3)，147.1(C-3′)，144.1(C-4)，144.5(C-4′)，132.6(C-1)，136.9(C-1′)，121.1(C-6′)，127.0(C-6)，115.5(C-5′)，116.3(C-5)，111.8(C-2′)，113.9(C-2)，62.6(C-9)，69.6(C-9′)，45.6(C-7′)，44.1(C-8′)，32.6(C-7)，37.6(C-8)，104.6(C-1″)，73.4(C-2″)，76.6(C-3″)，67.3(C-4″)，65.7(C-5″)，55.5、55.6(OCH3× 2)。以上数据和文献[23,24]报道一致，故鉴定为schizandriside。

2.3 活性部位所得成分对HDAC活性的抑制作用

我们检测了上述11个化合物以及淫羊藿药材指标成分淫羊藿苷在工作浓度为200、100和50 μM时对HDAC活性的抑制率。结果发现，在200 μM浓度下，十个黄酮类成分的HDAC抑制活性都高于淫羊藿苷(抑制率15.4%)，其中5个黄酮苷(化合物3～6和9)的HDAC抑制率为39.6%～54.5%，明显高于其他5个黄酮成分(抑制率 < 30%)；木脂素schizandriside (11)无HDAC抑制活性(见表3)。

表3 化合物1～11对HDAC酶活性的抑制作用(n = 2)Table 3 Inhibitory effects of compounds 1-11 on HDAC activity (n = 2)

鉴于山奈酚-3-O-单糖苷(3～5)显示了较好的HDAC抑制活性，且文献报道其苷元山奈酚为HDAC抑制剂[7]，我们进一步比较了这三个化合物和山奈酚在100、50、25 μM浓度时的HDAC抑制率。结果发现化合物3、4和5在100 μM时的HDAC抑制率分别为38.7%、31.3%和26.5%，均高于山奈酚(抑制率21.1%)(见表4)。

表4 化合物3～5和山奈酚对HDAC活性的抑制作用(n = 2)Table 4 Inhibitory rates of compounds 3-5 and kaempferol on HDAC activity (n = 2)

2.4 山奈酚-3-O-单糖苷(3～5)对宫颈癌HeLa细胞内HDAC蛋白表达的抑制作用

上述结果说明测试样品可直接作用于HDAC从而抑制其酶活性。对HDAC的抑制作用还可通过抑制HDAC蛋白在细胞内的表达来完成。随后我们以人宫颈癌细胞HeLa为模型测试山奈酚-3-O-单糖苷3～5对HDAC蛋白表达是否也具有抑制作用。首先测试了3～5在不同浓度下与HeLa细胞共孵育48 h时对细胞活力的影响，结果见表5。化合物3、4和5在100 μM时对细胞增殖的抑制率分别是28.0%、6.2%和10.5%，总体上对细胞生长的影响较弱。在此基础上测试了100和50 μM浓度的3～5作用于HeLa细胞24 h，对细胞中HDAC1-11(I、II和IV类HDAC)表达的影响。如图2所示，所有化合物对I类HDAC(HDAC1/2/3/8)表达无影响，但几乎完全地抑制了II类HDAC中的HDAC6的表达；化合物5还能明显抑制HDAC10(II类HDAC)的表达；化合物4则显著抑制所有的II类HDAC(HDAC4～7、9、10)和IV类HDAC(HDAC11)的表达，且作用具有剂量依赖性。因此，化合物4和5可作为新发现的HDAC抑制剂进行进一步研究。

表5 山奈酚-3-O-单糖苷(3～5)对宫颈癌HeLa 细胞增殖活力的影响Table 5 Effects of kaempferol-3-O-monoglycosides (3-5) on the viability of HeLa cells = 3)

图2 山奈酚-3-O-单糖苷(3～5)对宫颈癌HeLa细胞 表达HDAC1～11的影响Fig.2 Effects of kaempferol-3-O-monoglycosides (3-5) on the expression of HDAC1-11 in HeLa cells

3 讨论和结论

本实验确定了箭叶淫羊藿70%乙醇提取物抑制HDAC活性较强的溶剂部位是乙酸乙酯部位，该部位用D101大孔吸附树脂处理，40%和60%乙醇洗脱物为HDAC抑制活性部位(见图1)；通过活性指导下的柱层析分离和波谱分析，从中鉴定了11个化合物。其中，非异戊烯取代的黄酮苷元(化合物1)和黄酮苷(化合物2～10)类成分全部显示了比淫羊藿苷更强的HDAC抑制活性，说明这一类成分是该植物抑制HDAC活性的主要活性成分。分离到的9种黄酮苷中有6种是山奈酚-3-O-单糖苷，包括得率较高的化合物5(山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷)，说明山奈酚-3-O-单糖苷拥有相对较强的HDAC抑制活性。活性较低的化合物有7和8，由于糖基上一或两个羟基被对-香豆酸酯化，7和8的HDAC抑制活性低于异鼠李素-3-O-单糖苷(9和10)，说明山奈酚-3-O-单糖苷糖基被对-香豆酸酯化可减弱HDAC抑制活性(见表3)。但由于HDAC抑制剂筛选试剂盒提供的HDAC提取自HeLa的细胞核，是包含不同亚型HDAC的混合物，箭叶淫羊藿中分到的这些黄酮成分究竟抑制的是哪一种或哪几种HDAC的活性(功能)还需进一步研究方能得知。

如前所述，HDAC的抑制还可通过调节其在细胞内的表达达成。我们采用HeLa细胞进行的研究显示(见图2)，山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(3)、山奈酚-3-O-β-D-木吡喃糖苷(4)和山奈酚-3-O-β-D-葡萄吡喃糖(5)对I类HDAC表达无明显影响，但能明显抑制II型HDAC中的HDAC6(化合物3、4和5)和HDAC10(化合物4和5)的蛋白表达，是新发现的黄酮类HDAC蛋白表达抑制剂；其中4同时抑制其他II类(HDAC4～7)和IV类(HDAC9～11)HDAC的蛋白表达，其作用值得深入研究。

HDAC通过对核心组蛋白的去乙酰化从而压制特定基因的转录，在细胞转录调控、细胞周期进程和生长发育活动等不同阶段中发挥重要作用。选择性HDACi可作用于过度表达的HDAC，使被其压制的基因得以正常表达，从而在治疗肿瘤、关节炎、组织发育不良等疾病方面发挥作用。例如，HDAC1/2(I型)介导DNA损伤修复，在肺癌、胃癌等多种癌组织高表达。在对肿瘤进行放射性治疗时，同时使用HDAC1/2的抑制剂可阻止肿瘤细胞进行DNA修复从而促使癌细胞发生凋亡[25]。HDAC8(I型)和HDAC10(II型)的异常表达是神经母细胞瘤的进展和恶变的标志，HDAC6/8/10抑制剂TH34可诱导肿瘤细胞凋亡、有丝分裂中断和细胞周期阻滞，以此引起肿瘤细胞死亡；TH34与维甲酸联用可产生协同效果[26]。HDAC4/6/7(II型)的表达上调会造成成骨细胞分化过程中关键转录因子Runx2和Osterix表达下调，从而不利于成骨细胞的形成[27]；HDAC6基因和蛋白表达的上调也会诱导成骨细胞原纤毛变形和缩短，纤毛细胞数量减少，从而抑制成骨细胞的ALP功能，有效阻止骨形态发生蛋白(BMP)诱导的成骨细胞成熟[28]。抑制HDAC6和HDAC4的表达或功能，将有利于成骨细胞分化和骨形成，保护骨密度。

本研究数据首次揭示，箭叶淫羊藿中的山奈酚-3-O-单糖苷(化合物3、4和5)具有明确的HDAC抑制剂样作用，三者对HDAC6蛋白表达的抑制作用，为将其识别为淫羊藿药材中潜在的具有山奈酚-3-O-单糖苷结构特征的抗骨质疏松症抗肿瘤有效成分，提供了实验依据。