加工与贮藏条件对偃松种鳞精油抑菌活性和功能稳定性的影响1)

禚宇 孙文婕 李德海 蒋沙沙 祝清超

(东北林业大学，哈尔滨，150040) (内蒙古森工集团阿龙山森工公司苗圃)

偃松(Pinuspumila)是松科(Pinaceae Spreng. ex F. Rudolphi)松属(PinusLinn)常绿灌木，又名马尾松、五针松及日本石松，广泛分布在中国东北、俄罗斯远东、日本和朝鲜半岛[1]。偃松种子、芽、枝条、针叶、根部等，在东北亚民间药物中被用于治疗神经痛、皮肤病、风湿病、黄癣、关节炎、肺结核等疾病[2]。偃松的果实可食用，含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、多酚等生物活性物质[3]，是健身、健脑、滋补的良品[4]。偃松种鳞作为松仁的加工副产物，资源丰富，而且含有大量的挥发性精油，具有抑菌、抗氧化功能。但是，偃松种鳞精油易挥发、不稳定，导致加工利用率较低，不仅浪费生物资源，而且严重污染环境。

植物精油作为一种天然活性物质，具有良好的抗氧化、抑菌活性，已被广泛应用于医药保健、食品添加剂、化妆品等领域[5]。然而，由于精油的易挥发性、物理化学性质不稳定、热降解等缺点，使其在加工贮藏过程中容易受到环境因素的影响，从而降低生物活性[6]。温度、光照对精油香气成分含量和组分含量均存在不同程度影响，芳樟醇对温度、光照敏感度较低，在高温时，含量会有小幅度下降[7]；香茅醇、酯类、金合欢醇、烷烃类含量，在常温时变化趋势不明显，在高温时变化较大[8]。pH值低的环境，会使精油中酚类化合物所带的羟基的电离度下降，疏水性增加，更容易和细菌细胞膜结合，提高抑菌活性[9]。水分含量高、贮藏温度高、光照的条件时，精油更容易酸败，造成精油质量下降，从而对香味成分的稳定性、贮藏性造成不良影响；采用密封、避光、低温的条件，更加有利于精油香味成分的贮藏，使其发挥更好的功效[10-11]。但是，目前关于加工与贮藏条件对偃松种鳞精油抑菌功能稳定性的研究较少。

本研究以偃松种鳞为试验材料，采用盐析辅助水蒸气蒸馏法提取精油；以大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)4种常见腐败菌为供试菌，以抑菌圈直径、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度为评价指标，分析热、酸碱性、光照、金属离子和壳聚糖等处理条件对偃松种鳞精油抑菌活性和功能稳定性的影响。旨在为探索偃松种鳞精油的最佳加工和贮藏条件，避免精油在此过程的损失提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

偃松种鳞，于2020年11月份采自内蒙古阿龙山林业局，将其晾干后用高速万能粉碎机粉碎，过60目筛(孔径0.3 mm)，密封储存备用；NaCl、CaCl2、FeCl3、FeCl2、KCl，固体，购自天津市大茂化学试剂厂；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉，均采购于北京奥博星生物技术有限责任公司；二甲基亚砜(DMSO)，购自南通润丰石油化工有限公司；壳聚糖，购自国药集团化学试剂有限公司；大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)，供试菌种均来源于东北林业大学实验室。

主要仪器：Clevenger 精油提取装置(蒸馏瓶3 L，订制)；DS—T100 型高速多功能粉碎机(上海市顶帅工贸有限公司)；LT502E 型电子天平(常熟市天量仪器有限责任公司)；EL20 型实验室pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；高压蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司)；电热恒温培养箱(天津市塞得利实验分析仪器制造厂)。

1.2 偃松种鳞精油的提取

采用盐析辅助水蒸气蒸馏法[12]提取精油。称取偃松种鳞粉末200 g，置于3 000 mL的圆底烧瓶中，按m(种鳞)∶V(蒸馏水)为1 g∶8 mL的比例加入1 600 mL蒸馏水，同时加入8 g NaCl2，搅拌均匀后浸泡3 h。预处理完成后，连接Clevenger装置进行水蒸气蒸馏8 h；待装置冷却后，将得到的精油用无水硫酸钠干燥后，溶于灭菌后的二甲基亚砜溶液(体积分数为5%)中配制成体积分数为50%的精油溶液，4 ℃密封避光保存备用。

1.3 加工贮存条件

温度设计：将体积分数为50%的精油溶液，在4 ℃分别放置0、1、2、3、6、9、12、15 d；另取一定量的精油，在25、60、80 ℃，分别处理0、30、60、90、120、150、180 min。

pH设计：将体积分数为50%的精油溶液，分别用质量分数为2%的NaOH溶液、质量分数为50%的柠檬酸溶液，调节pH值为3、4、5、6、7、8、9、10；同时将无菌水调至不同pH值作为对照组。

紫外线照射设计：将体积分数为50%的精油溶液放置在紫外灯下(功率20 W，垂直距离35 cm)，分别照射30、60、90、120、150 min；对照组不进行处理。

金属离子溶液配制：用体积分数为5%的二甲基亚砜溶液，分别配制质量浓度为25 g/L的CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液；取2.5 mL精油、一定量的上述离子溶液均置于5 mL容量瓶中，用体积分数为5%的二甲基亚砜溶液定容，使得CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液的最终质量浓度均为5、10、15、20、25 g/L；以同质量浓度不含偃松种鳞精油的CaCl2、KCl、FeCl3、FeCl2溶液为对照组。

壳聚糖溶液配制：取适量壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液，用体积分数为5%的二甲基亚砜溶液定容后，配制成质量浓度为25 g/L的壳聚糖溶液；取2.5 mL精油、一定量的上述壳聚糖溶液均置于5 mL容量瓶中，用体积分数为5%的二甲基亚砜溶液定容，使得壳聚糖溶液的最终质量浓度为5、10、15、20、25 g/L；以同质量浓度不含偃松种鳞精油的壳聚糖溶液为对照组。

1.4 精油抑菌活性测定

菌悬液的制备：取出-80 ℃甘油冻藏的不同菌种，解冻后，将其接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，进行复苏。将复苏后的菌种接种到斜面培养基上，进行2～3次活化后，从斜面培养基上挑取1环菌体接种到液体培养基中，放入恒温震荡培养箱中，37 ℃培养至菌体的对数生长期后，采用平板计数法将菌悬液浓度调至106～107个/mL。

偃松种鳞精油抑菌圈直径测定：采用滤纸片法[13]对偃松种鳞精油的抑菌活性进行测定。无菌环境中，用移液枪取100 μL菌悬液置于含有固体培养基的培养皿上，涂布均匀后制成含菌平板，每个平板均匀放置3片直径为6 mm的滤纸片(滤纸片均已灭菌)。每片滤纸上滴加10 μL体积分数为50%的偃松种鳞精油溶液，用体积分数为5%的二甲基亚砜溶液作为对照。将培养皿用封口膜密封后，倒放在恒温培养箱中，37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径。

最低抑菌体积分数、最低杀菌体积分数的测定：采用倍比稀释法[14]，测定偃松种鳞精油对4种供试菌的最低抑菌体积分数、最低杀菌体积分数。取10支试管(编号1～10)——1号试管中，加入5 mL液体培养基，为空白；9号试管中，加入4 mL液体培养基、1 mL体积分数为5%的二甲基亚砜溶液、100 μL菌悬液；10号试管中，加入5 mL培养基与100 μL菌悬液，为阴性对照；2～8号试管中，加入100 μL菌悬液，再依次加入1 mL由体积分数为5%的二甲基亚砜溶液稀释的不同体积分数的偃松种鳞精油溶液(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mL/L，再加入4 mL液体培养基。将10支试管置于37 ℃培养24 h。培养结束后，分别取这4种菌悬液100 μL于固体培养基中进行涂布，放入恒温培养箱中37 ℃培养24 h，观察4种菌的生长情况。以无细菌生长的平板所对应的精油体积分数，为精油对该细菌的最低抑菌体积分数。

将上述平板继续培养24 h，观察细菌生长情况。以无细菌生长的平板所对应的精油体积分数，为精油对该细菌的最低杀菌体积分数。

1.5 数据处理

试验数据以“平均值±标准差”表示，所有数据利用Excel 2019、SPSS 21.0、Origin 8.0统计，进行数据方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 偃松种鳞精油的抑菌活性

精油抑菌圈直径：通过测量抑菌圈直径的大小，定性评价偃松种鳞精油对不同菌种的抑菌活性(见图1)。由表1可见：偃松种鳞精油对4种供试菌均有一定的抑菌效果，其抑菌活性，由大到小依次为大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌效果，好于对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果。革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌在细胞结构上存在差异；革兰氏阴性菌的细胞壁比较薄，交联松散，使得精油中的活性物质更容易经过细胞壁，破坏细菌细胞膜的通透性，并进一步影响细菌内部结构；因此，偃松种鳞精油对革兰氏阴性菌的抑菌活性，高于对革兰氏阳性菌的抑菌效果。

图1 偃松种鳞精油对4种供试菌的抑菌圈直径

表1 偃松种鳞精油对不同菌种的抑菌活性

最低抑菌体积分数(MIC)、最低杀菌体积分数(MBC)：通过最低抑菌体积分数、最低杀菌体积分数对4种供试菌的抑菌效果进行定量分析表明(见表2)，不同的菌种对精油的敏感程度不同，最低抑菌体积分数、最低杀菌体积分数也不同。偃松种鳞精油，对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌4种供试菌的最低抑菌体积分数，分别为5.000、10.000、20.000、20.000 mL/L；对大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌4种供试菌的最低杀菌体积分数，分别为10.000、20.000、40.000、40.000 mL/L。由此可见，少量的偃松种鳞精油便可抑制细菌的生长，实际应用成本比较低。

表2 偃松种鳞精油对4种供试菌的抑菌效果

2.2 温度对精油抑菌活性的影响

由表3可见：在4 ℃贮藏精油，随时间的增加4种供试菌的抑菌圈直径基本无变化。因此，认为精油在4 ℃可以长期存放，且稳定性较好。由表4可见：25 ℃时，随时间的增加抑菌圈直径基本不变，精油的抑菌活性稳定；在60、80 ℃时，随着处理时间的延长，精油对4种供试菌的抑菌圈直径明显降低，因此，可以认为精油的贮藏温度越高其抑菌的效果越差。这表明，精油中所包含的抑菌物质，在高温条件时挥发或者失去活性，从而影响了精油对细菌的抑制作用。因此，在精油的加工、应用过程中，应将温度控制在室温条件下，以避免高温导致精油的抑菌活性降低。

表3 4 ℃时不同处理时间的精油抑菌稳定性

2.3 pH对精油抑菌活性的影响

由表5可见：精油对大肠杆菌的抑菌圈直径，从pH=3的(14.25±0.14)mm逐渐降低到pH=10的(10.85±0.13)mm；精油对其他菌种的抑菌圈直径，也随着pH的增大逐渐降低；可以看出，随着pH的增大，偃松种鳞精油的抑菌活性逐渐降低。借鉴文献[15]并结合本研究结果，认为造成这一现象的原因主要是，细菌在酸性环境中自身的活性降低，使得精油可以更好地抑制其生长；其次，pH的降低，会减小精油活性成分上所带有的羟基的电离度，疏水性增加，使精油与细菌菌体的细胞膜及其脂蛋白的结合变得更加容易，进一步提高了抑菌活性。

表4 25、60、80 ℃时不同处理时间的精油抑菌稳定性

表5 不同pH时的精油抑菌稳定性

2.4 紫外照射对精油抑菌活性的影响

由表6可见：随着紫外线照射时间的不断延长，偃松种鳞精油对4种不同供试菌的抑菌效果基本没有变化，保持了良好的稳定性；该结果与艾薇等[16]研究一致。主要是因为，精油中所含的成分多为醇类、烯萜类物质，这些物质都对紫外线有较好的稳定性，在紫外线照射时不会发生结构上的改变，因此精油在紫外线的照射下抑菌活性保持稳定。

2.5 金属离子对精油抑菌稳定性的影响

由表7可见：金属离子Ca2+、Fe3+、Fe2+、K+对4种供试菌均有一定的抑菌效果，但抑菌效果不显著。由表8可见：添加不同的金属离子溶液后，精油对4种供试菌的抑菌圈直径，随着金属离子质量浓度的增大而增大，抑菌效果明显增强。借鉴文献[17]并结合本研究结果，认为金属离子靠近细菌细胞时，会破坏细菌细胞膜，从而使细菌失去繁殖能力，导致死亡；当金属离子与精油结合使用时，金属离子破坏细胞膜，使得精油更容易与细菌结合，加速细菌细胞凋亡，提升了精油的抑菌效果。

表6 紫外线照射时间不同时的精油抑菌稳定性

2.6 壳聚糖对精油抑菌活性的影响

由表9可见：壳聚糖本身具有一定的抑菌活性，且随着壳聚糖质量浓度的增大，活性增强。加入壳聚糖后，偃松种鳞精油溶液对4种供试菌的抑菌圈直径明显增大。目前，壳聚糖多是采用制备复合膜以及微胶囊与精油结合，以提高精油的稳定性和抑菌活性，使其更好地应用在果蔬及肉制品保鲜中[18-19]；本研究结果表明，当壳聚糖与偃松种鳞精油结合使用时，抑菌效果会得到提升，这也为精油的进一步应用提供了技术支撑。

表7 金属离子对4种供试菌的抑菌效果

表8 添加不同质量浓度金属离子的精油抑菌效果

表9 壳聚糖及其对精油的抑菌效果

3 结论

偃松种鳞精油对4种供试菌的生长，均有一定的抑制作用，其抑菌活性，由大到小依次为大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌；由于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌细胞结构和组成成分不同，导致其对革兰氏阴性菌的抑制作用大于对革兰氏阳性菌的作用。

抑菌稳定性的研究结果表明，偃松种鳞精油对紫外线有较强的稳定性。

在酸性环境中，偃松种鳞精油的抑菌活性提高；而在碱性环境中，精油的抑菌效果下降。

在4、25 ℃时，偃松种鳞精油有较好的抑菌稳定性；而在60、80 ℃时，偃松种鳞精油抑菌活性会随着时间的延长而下降。壳聚糖、金属离子的添加，都会使偃松种鳞精油的抑菌效果有所提升。本研究为偃松种鳞精油的贮藏加工与应用提供了技术参考，有利于偃松种鳞精油的进一步开发与利用。