miR-10b、LMP1和Twist1联合检测在鼻咽癌早期诊断及复发诊断中的应用

魏晓 陈鹏 张艳

鼻咽癌是一类高发恶性肿瘤，多发生于咽隐窝、鼻咽顶壁等处，目前全球范围内每年发病人数高达八万以上，病死人数接近五万［1-2］。研究显示，该病对放化疗表现出较高的敏感性，患者在疾病发现早期进行积极治疗后五年生存率可达到80%，但部分患者进展至中晚期后肿瘤远端转移、局部浸润程度较高，其预后生存情况并不理想［3-4］。微小RNA（microRNA，miRNA）作为参与细胞增殖、代谢、凋亡的重要RNA 分子，在机体肿瘤、炎症病变中发挥重要参与作用［5］。其中miR-10b基因可在肝癌、肾癌等多种恶性肿瘤患者肿瘤侵袭、转移中出现表达异常；与潜伏膜蛋白1（Latent membrane protein 1，LMP1）相关的EB 病毒与鼻咽癌关系紧密，LMP1 作为此类病毒的基因产物，具有一定的癌基因功能，可参与此类疾病病情进展［6-7］；Twist 相关蛋白1（Twist related protein 1，Twist1）则在褐色脂肪代谢、胚胎发育中作用关键，其可于多种肿瘤中有所表达［8］。目前临床对上述指标与鼻咽癌诊断的研究较少，本次研究将探究其水平在鼻咽癌早期诊断以及复发诊断中的效能。现将所得成果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6月至2019年12月期间于郑州颐和医院行各项检查的82 例疑似鼻咽癌受检者临床资料，根据后续实际诊断结果分为确诊组51 例与未确诊组31 例，将确诊组根据后续实际复发情况分为复发组23 例与未复发组28 例。纳入标准：①均于本院接受各项相关检查；②复发组患者均符合中国抗癌协会鼻咽癌专业委员会制定的《复发鼻咽癌治疗专家共识》相关诊断标准［9］；③所有人员均为初次诊治，未经相关治疗，且临床资料保存完整。排除标准：①存在严重感染状态者；②合并颌面部周围组织严重病变或其他类型恶性肿瘤者。受检者一般资料：男62 例，女20 例；平均年龄（46.39±12.36）岁。确诊组患者TNM 分期［10］：Ⅰ期11 例，Ⅱ期40 例；肿瘤转移情况：伴淋巴结转移33例，无淋巴结转移18 例。

1.2 方法

采用实时荧光定量PCR 法检测血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，收集受检者静脉血10 mL，经3 500 r/min 离心10 min 后分离血清，采用Trizol reagent RNA 提取试剂盒对血清中RNA 进行提取检测，并以Nanodrop 判断RNA 浓度，随后将RNA 作为模板逆转录合成cDNA，miR-10b上游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAATT-3′，下游引物序列：5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；LMP1上游引物序列：5′-ACACACTGCCCTGAGGATG-3′，下游引物序列：5′-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3′；Twist1上游引物序列：5′-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3′，下游引物序列：5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3′。miR-10b在95℃下进行30 s 预变性以及5 s 变性，随后60℃下进行30 s 退火，并于70℃进行30 s 延伸，循环共持续40 个；LMP1、Twist1 在95℃下进行60 s 预变性以及20 s 变性，随后58℃下进行25 s 退火，并于70℃进行30 s 延伸，循环同样持续40 个。随后通过2-ΔΔCT法对上述三个指标相对表达量进行测定。

1.3 观察指标

比较确诊组与未确诊组血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，采用受试者工作特征（ROC）曲线评估上述指标各自对鼻咽癌的早期诊断效能及联合诊断效能；比较复发组与未复发组血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，采用ROC 曲线评估上述指标各自对鼻咽癌复发的诊断效能及联合诊断效能。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 21.0 分析数据，计量资料用（）表示，采用独立样本t检验进行组间比较，诊断效能分析采用ROC 曲线，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 确诊组与未确诊组血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比较

确诊组血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平均显著高于未确诊组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 确诊组与未确诊组血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比较（±s）Table 1 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between confirmed group and unconfirmed group（±s）

表1 确诊组与未确诊组血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比较（±s）Table 1 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between confirmed group and unconfirmed group（±s）

组别确诊组未确诊组t 值P 值n 51 31 miR-10b 7.86±1.42 5.78±1.03 7.092＜0.001 LMP1 mRNA 4.83±0.92 3.32±0.76 7.678＜0.001 Twist1 mRNA 4.12±0.89 2.78±0.65 7.278＜0.001

2.2 血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA早期诊断鼻咽癌的效能分析

血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 联合早期诊断鼻咽癌的ROC 曲线AUC 为0.978，优于单一诊断（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 ROC 曲线参数Table 2 ROC curve parameters

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

复发组miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA水平均显著高于未复发组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 复发组与未复发组血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比较（±s）Table 3 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between recurrence group and non-recurrence group（±s）

表3 复发组与未复发组血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比较（±s）Table 3 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between recurrence group and non-recurrence group（±s）

组别复发组未复发组t 值P 值n 23 28 miR-10b 8.76±1.02 7.12±1.26 5.030＜0.001 LMP1 mRNA 5.44±0.92 4.32±0.97 4.198＜0.001 Twist1 mRNA 4.62±0.86 3.70±0.75 4.080＜0.001

2.4 血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA诊断鼻咽癌复发的效能分析

miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 诊断鼻咽癌复发的ROC 曲线AUC 分别为0.804、0.818、0.733，三者联合诊断AUC 为0.932（P＜0.05），见表4、图2。

表4 ROC 曲线参数Table 4 ROC curve parameters

图2 ROC 曲线Figure 2 ROC curve

3 讨论

鼻咽癌是国内头颈部恶性肿瘤中常见的类型，早期诊断及治疗极为重要，目前放疗作为其早期主要治疗方式具备显著疗效，但不良反应较多，且面临局部复发、转移风险［11］，故临床仍需进一步探究用于其早期诊断及复发诊断的标志物。

人类2q31 HOXD 基因簇中的miR-10b编码基因可通过与下游靶基因3'-非编码区相结合达成对多种靶基因表达的调控，在机体出现心血管病变、自身免疫性疾患以及恶性肿瘤后，其表达可发生明显异常变化。孙秀英等［12］研究发现鼻咽癌患者癌组织miR-10b 与LMP1、Twist1mRNA 的表达呈正相关，与鼻咽癌肿瘤TNM 分期亦有显著相关性。王述莲等［13］研究发现，乳腺癌患者发病过程中可伴随miR-10b 水平的上升，而在相关体外实验中亦发现miR-10b 可促进肿瘤细胞侵袭过程。EB病毒作为一类嗜淋巴细胞病毒，在人体感染后大多处于潜伏状态，而在肿瘤病情进展等条件下可进行二次复制，并通过病毒编码产生LMP1，以达到促进肿瘤细胞增殖、抑制其凋亡并诱导B 淋巴细胞分化的作用。陈俊妮等［14］研究发现，LMP1 与鼻咽癌患者肿瘤分期、颈部淋巴结体积等具有显著相关性，可作为预测鼻咽癌远处转移的重要分子标志物。本研究中，上述两种指标均在确诊组患者中呈高表达水平，且肿瘤复发患者表达水平高于未复发患者。ROC 曲线分析发现，miR-10b、LMP1 在鼻咽癌早期诊断及复发诊断中效能显著，与上述研究结果相似。此外，miR-10b 属于致癌miRNA，可对岩藻糖基转移酶8 发挥一定调控作用，使蛋白激酶信号通路得以激活，从而加剧肿瘤细胞增殖及局部浸润，另一方面，其表达水平的上升可对同源性磷酸酶张力蛋白基因等抑癌基因表达产生一定抑制作用，有利于肿瘤细胞增殖。吴克复等［15］研究指出，EB 病毒隐性感染可诱发免疫失调，引起机体免疫失控、局部淋巴增生及超炎症状态，有助于鼻咽癌等恶性肿瘤形成，此外EB 病毒感染引发的代谢类型改变亦可支持病毒持续感染，此类改变亦可能导致肿瘤发生。在鼻咽癌发生后EB 病毒可从潜伏状态活化，从而导致LMP1mRNA 水平上升，使LMP1作为活性受体激活蛋白激酶途径、核因子κB 等多种胞内信号通路，使血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等癌基因表达上升，促进肿瘤增殖、迁移。

Twist1基因可参与神经管闭合、神经发育以及褐色脂肪代谢等过程的调节，其属于碱性螺旋-环-螺旋蛋白家族中高度保守的转录因子，在胚胎发育过程中可调节组织重建，达到促进细胞迁移的作用，此外Twist1亦是促进多种肿瘤转移、侵袭的关键基因，在鼻咽癌转移中也可发挥重要作用［16］。本研究中，Twist1 在确诊组及复发组中表达水平更高，且经ROC 曲线分析发现，Twist1 在鼻咽癌早期诊断及复发诊断中效能显著，与上述研究背景相似。分析其原因，Twist1 作为转录因子可诱导上皮间质转化，使上皮细胞发生形态学改变向间充质细胞表型转变，并因此获得迁移能力，使上皮细胞或组织分离、迁移至其他部位。故认为Twist 诱导上皮间质转化程序为鼻咽癌转移启动的重要原因。

综上所述，血清miR-10b、LMP1、Twist1 可应用于鼻咽癌早期诊断及复发诊断，其联合应用可表现出更佳诊断效能。