苯并异噻唑啉酮酰胺衍生物的合成及其对柞蚕链球菌的抑菌活性评价

刘铁成陈有嗣杨金琛刘洪丽曾 航赫英姿王立石牛雄雷

(1.辽宁省蚕业科学研究所,辽宁 凤城 118100; 2.辽宁省蚕药专业技术创新中心,辽宁 凤城 118100)

柞蚕空胴病又称软化病,俗称“稀屎腚”[1～5]。柞蚕空胴病致病菌为柞蚕链球菌,现归属为柞蚕肠球菌(文中按传统习惯,均称之为柞蚕链球菌)[6～8]。柞蚕链球菌既可通过卵面传播,也可较长时间存活于蚕场土壤、枯落物中,引起柞蚕世代之间的水平传播[9],还存在于20余种蚕场共生昆虫中,可引起蚕场共生昆虫与柞蚕的交叉传染[10]。因此,该病害发生较为普遍,在辽宁蚕区空胴病发病率可达年均30%～40%,严重时可达70%以上。

对于其防治,现有防治措施主要基于严格的选蛾留种和采用醛类或氯制剂进行消毒,降低该病菌的卵面传播风险[11～14]。但是,对于蚕期叶面取食感染环节的防控,零星报道见于蚕得乐、蚕康宁等,蚕农反馈其生产应用效果不尽如人意[15～16]。近年,受异噻唑啉酮类型药剂在家蚕防病领域应用的启发[17],开发非醛类或非氧化消毒剂类型的防治药剂引起了我们的关注。

苯并异噻唑啉酮(Benzisothiazolinone 以下简称BIT)是一类作用温和的、广谱、高效杀菌剂[18]。前期工作表明,尽管离体条件下125 mg/L BIT处理可完全杀灭柞蚕链球菌,但室内养蚕试验表明其活体防治活性不理想,使用浓度1 000 mg/L 1次用药防效为61.2%,使用浓度500 mg/L 2次用药防效仅为84.1%。究其原因,从药物代谢角度分析,或许是因为BIT易溶于水,其滞留蚕体难而代谢排出易,药效作用时间相对较短。从结构决定活性角度分析,BIT易溶于水源自其结构中亲水性结构——较活泼的N-H键。若将其酰化则可提升化合物的疏水性,而疏水性改变如何影响化合物的防治活性则值得探索。因此,首先我们采用计算软件确证设计化合物的疏水性参数LogP获得较大范围的调控,挑选代表性结构和原料易得的化合物进行了合成,然后在确认化合物结构基础上,进行了衍生物的离体和活体抑菌活性测定,相关结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与器材

SQP型电子天平、THZ-82振荡培养箱(常州国华电器有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、电磁搅拌油浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司),移液器、E100显微镜(日本Nikon)、SC-3610低速离心机(科大创新中佳分公司)、养虫盒、100 mm培养皿。

1.1.2 化学试剂

BIT、乙酰氯、丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯、4-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯、无水吡啶均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蔗糖、蛋白胨、氯化钠、牛肉粉、硫酸钠、石油醚和乙酸乙酯购自沈阳国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 供试菌种及试蚕

试蚕柞蚕品种为9906,由本单位保存繁育;供试菌种柞蚕链球菌(Streptocouccuspernyisp.Nov.)由辽宁省蚕业科学研究所柞蚕保护研究室提供。

1.2 试验方法

化合物的设计:利用Molinspiration Cheminformatics网络开放软件JME Molecular Editior,输入拟合成化合物的结构,计算获得化合物的正辛醇/水分配系数对数值(LogP)[19～21],作为合成选择依据。

化合物的合成: 参照文献,以XA1为例,制备BIT乙酰化产物[22]。 称取10.08 g BIT(0.067 mol),置于配备搅拌磁子、温度计和冷凝器的100 ml三口瓶,向三口瓶中加入45 ml二氯甲烷、9.0 g无水吡啶,冰水浴搅拌下,用恒压滴加器滴加7.13 g乙酰氯(0.090 mol)与5 ml的二氯甲烷混合溶液,30 min滴加完毕,然后室温反应1 h。反应结束将反应混合液倒入分液漏斗中,采用60 ml蒸馏水洗涤3次,有机相经无水硫酸钠干燥,过滤,减压蒸馏脱除溶剂,得到白色固体。按照相似方法,可制备表2中所有化合物;不同的是:反应时将原料乙酰氯变为丙酰氯、丁酰氯、戊酰氯、己酰氯、庚酰氯、苯甲酰氯、4-氟苯甲酰氯、2-氟苯甲酰氯、4-甲基苯甲酰氯、4-氯苯甲酰氯,依次编号为XA2～11。

化合物的表征:采用WRS-1A(1B)数字熔点仪(上海精科公司产)测定化合物的熔点(温度未校正);采用AvanceⅢ 400核磁共振仪(Bruker公司产)测定化合物的1H-NMR谱。

1.3 化合物的抑菌活性测定方法

涂平板数菌落法测定衍生物离体抑菌活性 取5 ml离心管,将3 200 μl液体培养基(组成以1 000 ml为例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化钠5 g、牛肉粉5 g,加蒸馏水至1 000 ml,用氢氧化钠调节pH=9,121 ℃湿热灭菌30 min。)中 加 入 400 μl菌 液、400 μl不 同 浓 度(500 mg/L、125 mg/L、62.50 mg/L、31.25 mg/L、15.625 mg/L)的化合物DMSO溶液,在漩涡混匀仪上混合均匀,柞蚕链球菌的终浓度为1.8×107CFU/ml;加样操作在2 h内完成,以上混合液在振荡培养箱中37 ℃、130 r/min条件下培养24 h。培养结束后将混合液分别逐级稀释至1 000倍,用移液器取1 000倍稀释液100 μl涂平板(固体培养基组成以1 000 ml为例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化钠5 g、牛肉粉5 g,加蒸馏水至1 000 ml,用氢氧化钠调节pH=9,琼脂20 g,121 ℃湿热灭菌30 min。较液体培养基比含有2%琼脂),涂菌平板置于培养箱中37 ℃下培养24 h后取出查数菌落个数。空白对照CK即将药液替换为无菌水。药剂处理抑菌率计算公式:

琼脂孔穴扩散法测定抑菌圈:制备含菌平板(固体培养基组成以1 000 ml为例,蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化钠5 g、牛肉粉5 g,加蒸馏水至1 000 ml,用氢氧化钠调节pH=9,琼脂15 g加热溶解。)将培养基趁热分装到试管中,每试管12.5 ml,封口后121 ℃湿热灭菌30 min。灭菌后待培养基温度降至55 ℃时,每试管加入浓度为6.5×106CFU/ml柞蚕链球菌液125 μl,迅速震荡均匀后倒入90 mm培养皿(每皿一次同时倒2只试管)冷却后制成含菌平板,于-4 ℃中冷藏备用。用无菌打孔器在每个含菌平板上均匀打9个孔,每孔加入5 μl不同浓度(500 mg/L、1 000 mg/L)的化合物DMSO溶液,每种药液加3孔。加药后在室温下扩散2 h,之后于37 ℃培养24h。培养结束后用游标卡尺测量抑菌圈直径。空白对照CK即将药液替换为DMSO。

图1 BIT酰胺衍生物合成路线

化合物柞蚕体内抑菌活性测定:5月于辽宁凤城市室外,将柞蚕品种9906的无菌种卵置于柞树孵化,得到蚁蚕试虫,记作试虫A。室内,将新采摘的带叶树枝置于含水的海绵底座,将新培养分离提纯的链球菌加无菌水稀释至1×108CFU/ml后,喷施上述柞叶,待叶面菌液晾干后将1～2日龄的蚁蚕分散于树叶,待柞蚕取食含菌树叶48 h后得到添食柞蚕链球菌的蚁蚕试虫,记作试虫B。

药剂处理:每处理随机挑选试虫B 15头,置于单个养虫盒中;在喷壶中将实施例2或实施例4中制备的化合物乳油加无菌水稀释至相应浓度,喷施于柞树叶面至布满雾滴,0.5 h内晾干后采摘加入养虫盒,由试虫取食48 h以上,每处理设3次重复;每个化合物分别设置2个处理浓度(500 mg/L、1 000 mg/L)。养虫盒中试虫经过一次药剂处理之后,放置不经药物处理的新鲜柞树叶饲养至四龄期。期间,跟踪标记,清除蚕沙和杂物,适时添食新鲜柞树叶,及时剔除发病或死亡试蚕,调查各处理剩余蚕数,累计空胴病发病或死亡蚕总数N,计算发病率。

对照处理:在单个养虫盒放置试虫B 15头,采用不经药剂处理的新鲜柞树叶喂养,设3次重复,作为空胴病毒对照CK-D;在养虫盒正常饲养试虫A 15头,采用不经药剂处理的新鲜柞树叶喂养,3次重复,作为空胴病空白对照CK-0。跟踪标记,清除蚕沙和杂物,适时添食新鲜柞树叶,及时剔除发病或死亡试蚕,饲养至四龄期,调查各处理剩余蚕数,累计空胴病发病或死亡蚕总数N。

空胴病发病率、防效计算公式如下:

2 结果与讨论

2.1 BIT酰胺衍生物的设计合成与结构表征

2.1.1 BIT酰胺衍生物的设计合成

采用JME Molecular Editior计算得到的化合物参数如表1所示,可见,对于取代基R为烷基,随着碳链数从1增长至8,拟合成化合物LogP值以每增加1个碳数增加～0.5递增,且当碳数超过7时,LogP数值大于5;对于R基为取代苯基时,拟合成化合物LogP值均介于3.32～4.17。文献表明药物LogP高于5时口服生物利用度很低[21],因此,取代基R为烷基链时,选取链长碳数为1～6进行合成;取代基R为表中芳基时,理论上可悉数合成,实际合成时兼顾原料的可及性(化合物No.14,15因合成原料昂贵而舍弃)。

表1 拟合成化合物的LogP计算值

2.1.2 BIT酰胺衍生物的表征

按照文献方法,合成BIT酰胺衍生物如表2所示,其熔点熔程均介于2～5 ℃,说明化合物纯度较高,1H-NMR谱分析表明,所得化合物的氢原子种类和数量均与目标设计理论结构相符[22]。这说明,所得化合物即为目标设计结构。

表2 供试BIT酰胺衍生物(XA1～11)

2.2 BIT酰胺衍生物的生物活性评价

2.2.1 BIT酰胺衍生物抑菌率涂平板数菌落数法测定结果

涂平板数菌落法定量测定了BIT酰胺衍生物对柞蚕链球菌的抑菌率,结果表明(表3),化合物使用浓度不低于62.5 mg/L时, XA1～11的抑菌效果均超过99%,无明显差异。当化合物浓度为31.25 mg/L时, XA1～4,XA6～8抑菌活性可达到96%以上,其中XA2、XA6,XA7、XA8均达到99%,与母体化合物BIT相当,XA5,XA9～11四个化合物抑菌活性低于95%。结果说明: BIT酰胺衍生物抑菌活性总体低于母体化合物,且随着浓度降低,抑菌活性出现分化。

表3 由涂平板数菌落法测得BIT酰胺衍生物的抑菌活性

2.2.2 BIT酰胺衍生物抑菌圈试验结果

设定处理浓度为500 、1 000 mg/L,采用琼脂孔穴扩散法测定了BIT酰胺衍生物的抑菌活性,结果(表4)表明,当处理浓度为500 mg/L时,XA1～XA5,即取代基R为烷基时,衍生物抑菌圈可测得,其中XA1抑菌圈直径最大,为9.3 mm;XA7～11,即取代基R为芳基时,其抑菌圈未测得。当处理浓度增加至1 000 mg/L时,除了XA8外均存在抑菌圈,衍生物中XA1抑菌圈直径最大,为12.20 mm,与母体化合物BIT抑菌圈数值(12.56 mm)最为接近。

表4 由琼脂孔穴扩散法测得BIT酰胺衍生物的抑菌活性

2.2.3 BIT酰胺衍生物柞蚕体内防治活性测定结果

由表5数据可知,处理浓度为500 mg/L时,BIT酰胺类衍生物的治疗活性较低,化合物XA3防效最大,为10.7%,远低于对照母体化合物的防治活性59.1%。当使用浓度为 1 000 mg/L时,化合物的防治活性有所增加,但总体活性不足20%,远不及相同浓度下母体化合物BIT的防效(61%)。

表5 BIT酰胺衍生物在柞蚕体内空胴病防治活性比较

3 结论

采用Molinspiration Cheminformatics网络开放软件JME Molecular Editior辅助设计,合成了11个BIT酰胺衍生物,其中取代R基为直链烷烃基6个,取代芳香基5个,其结构经熔点测试和1H-NMR分析确认。

涂平板数菌落数法测定结果表明,BIT酰胺衍生物较之BIT抑菌活性降低:要达到99%以上抑菌活性(对柞蚕链球菌有预防作用),使用浓度应达到62.5 mg/L。琼脂孔穴扩散法结果表明,处理浓度较低(500 mg/L)时,衍生物的抑菌圈较小或未测得,抑菌活性显著弱于BIT;处理浓度提高至1 000 mg/L,衍生物抑菌圈有所增加,总体低于母体化合物,仅衍生物XA1抑菌活性最接近母体化合物。初步的活体抑菌实验表明,不同处理浓度(500、1 000 mg/L)下,BIT酰胺衍生物的空胴病治疗活性均不及母体化合物BIT。说明BIT酰胺化改造不能提升其对柞蚕链球菌的防治活性。为提高抑菌活性特别是柞蚕体内的抑菌活性,进一步的BIT衍生改造不但要考虑疏水性问题,还要考虑化合物的电性等其他内在影响因素。