1株野生高大环柄菇的鉴定、生物学特性及仿野生栽培

刘潇文， 陈润臣， 徐 晨， 王鸿磊， 王红艳， 丁 强

(中国农业大学 烟台研究院， 山东 烟台 264670)

0 引言

【研究意义】野生食用菌具有极高的营养价值和经济价值，越来越受到人们的重视。目前大多数野生食用菌主要依赖于野外采集，随着野生食用菌需求量的逐年增加，造成野生菌的过度开采，严重破坏生态环境[1-3]，故野生菌人工驯化势在必行。【前人研究进展】高大环柄菇(Macrolepiotaprocera)也称为高脚环柄菇、高柄环菇、棉花菇等，国外别称阳伞蘑菇，属于担子菌门层菌纲伞菌目蘑菇科大环柄菇属。其子实体较大，最高可达30～40 cm，广泛分布于温带地区[4-6]。高大环柄菇质地脆嫩、味道鲜美、营养丰富，人体必需氨基酸含量高，是一种很有开发前景的野生食用菌[7]。在欧洲高大环柄菇是一种很受欢迎的食用菌，在国内仅有零星栽培报导[8-10]。【研究切入点】目前对高大环柄菇的子实体形态特征、菌种生物学性质、栽培特性等缺乏系统研究，且尚无大规模人工栽培的记录。关于其他方面的报道也甚少[11]，偶有关于菌丝生长条件的相关研究，其研究方面也不甚全面，对于大规模栽培而言参考不够[12]。【拟解决的关键问题】采用形态学和分子学相结合的方法对2016年9月采集的1株高大环柄菇属真菌子实体进行鉴定，采用单因素试验，以菌丝生长量为指标研究其生物学特性，在此基础上进行仿野生栽培，以期为丰富山东省食用菌栽培品种，实现高大环柄菇的人工栽培提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 2016年9月采集于烟台市高新区林地内，于中国农业大学烟台研究院食用菌实验室分离保藏，编号为EF-5。

1.1.2 试剂 大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、红糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糖蜜、纤维素、KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等，市购。

1.1.3 其他 ITS通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，购于生工生物工程(上海)股份有限公司；土豆浸粉、琼脂、麦粒、麸皮、木屑、玉米芯及石灰，市购。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备

1) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)。采用土豆浸粉10 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL制备。

2) 马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB培养基)。采用土豆浸粉10 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL制备。

3) 氮源培养基。采用蔗糖20 g，MgSO40.5 g，琼脂20 g，水1 000 mL制作基础培养基，然后分别添加1%的大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨和0.5%的硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾等制成不同氮源培养基备用。

4) 碳源培养基。采用土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，琼脂20 g，水1 000 mL制作基础培养基，然后分别添加2%的红糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、糖蜜、纤维素和蔗糖等制成不同碳源培养基备用。

5) 无机盐培养基。采用糖蜜20 g，土豆浸粉10 g，琼脂20 g，水1 000 mL制作基础培养基，然后分别添加0.1%的KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等制成不同无机盐培养基备用，以不加无机盐的培养基做对照。

6) 二级种培养基。采用麦粒90%、麸皮10%制备。

7) 栽培培养基。参照文献[13]的方法采用木屑50%、玉米芯38%、麸皮10%、石灰2%配制栽培培养基，含水量65%。

1.2.2 菌株鉴定

1) 形态学观察和菌种分离。参照文献[12-14]的方法，于烟台市高新区林地内发现高大环柄菇子实体1个，拍摄子实体、菌褶等照片。采集子实体，取菌盖和菌柄连接处的菌肉组织，接种于PDA培养基平板上，24℃培养得到高大环柄菇菌种。

2) 分子生物学鉴定。参照文献[15-20]的方法，将高大环柄菇菌种接种至PDB培养基中，150 r/min，24℃培养10 d。取适量菌丝体液氮研磨，利用CTAB法提取基因组DNA，再利用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4扩增高大环柄菇基因组ITS序列，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送生工生物(上海)股份有限公司进行测序。采用NCBI的BLAST比对真菌PCR扩增产物的测序结果，获取相似性较高的菌株，用MEGA 5.0构建系统发育树。

1.2.3 生物学特性观察及指标测定 参照文献[15-17]的方法研究菌株的生物学性质。

1)菌落和菌丝形态特征。将高大环柄菇菌种接种至PDA培养基平板上，24℃培养6 d后观察菌落形态特征并拍照。另将高大环柄菇菌种接种至PDA培养基平板上，在距接种块1.5 cm处斜插1片盖玻片，24℃培养5 d。取1片洁净载玻片，滴1滴美兰染色液，将盖玻片有菌丝一面盖到染色液处，显微镜观察菌丝形态特征。

2) 菌丝生长温度。菌丝培养温度设7个处理，即5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。用Φ8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，接种于PDA培养基平板表面，然后置于不同温度下培养。培养8 d测量菌落直径，计算菌丝生长量(下同)。

菌丝生长量=(菌落直径-接种块直径)/2。

3) 菌丝生长pH。根据菌丝培养pH不同，设8个处理，即pH为4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。按试验要求制备相应pH的PDA培养基平板，用Φ8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，接种于不同pH的PDA平板中央，24℃培养8 d，测量菌落直径，计算菌丝生长量。

4) 菌丝生长氮源。按照添加氮源不同，设9个处理，每种氮源1个处理，即大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨和硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾等。用Φ8 mm打孔器打取菌落边缘的菌丝块，分别接种于各氮源培养基表面，25℃培养8 d，测量菌落直径并计算菌丝生长量。

5) 菌丝生长碳源。按照添加碳源不同，设8个处理，每种碳源1个处理，即红糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、糖蜜、纤维素和蔗糖等。菌丝接种、培养及测定方法同上。

6) 菌丝生长无机盐。按照添加无机盐不同，设10个处理，每种无机盐1个处理，即KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等，以不加无机盐为对照。菌丝接种、培养及测定方法同上。

1.2.4 栽培试验 将高大环柄菇菌母种接种至二级种培养基中，24℃培养直至长满。取二级种接种到栽培培养基中，培养至长满菌袋。将菌袋脱去，埋入毛樱桃林内进行仿野生栽培。

1.3 数据处理

采用R语言对数据进行统计分析及绘图，利用MEGA构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 高大环柄菇的形态学及分子生物学鉴定

2.1.1 形态学鉴定 从图1看出，高大环柄菇子实体近白色，菌盖直径约8.5 cm，上覆有棕褐色鳞片，呈同心圆状排列，中央乳头状凸起，褐色。菌柄中生，长8.2 cm，直径0.8 cm，棕黄色，较细长，较韧，上有双层移动菌环。菌褶近白色，不等长，靠外缘处曲折，其余部分平直，离生，孢子印白色。菌落不规则圆形，灰白色。菌丝多分枝，具锁状联合。

注：A子实体，B菌盖正面，C菌环，D菌褶，E菌落，F菌丝和锁状联合。

2.1.2 分子生物学鉴定 该真菌PCR扩增产物约700 bp，登陆NCBI，用BLAST程序比对测序结果，获取相似性较高的高大环柄菇30654(Macrolepiotaprocera30654)、白大环柄菇 YSU-1(MacrolepiotapuellarisYSU-1)、长柄大环柄菇 MFLU121764(MacrolepiotadolichaulaMFLU121764)等菌株，构建获得系统发育树(图2)，该菌株(EF-5)与高大环柄菇菌株30654遗传距离达99%，结合形态学特征鉴定其为高大环柄菇(Macrolepiotaprocera)。

图2 高大环柄菇EF-5系统发育树

2.2 高大环柄菇的生物学特征

从图3看出，不同生长条件对菌丝生长的影响存在差异。

2.2.1 温度 随着培养温度升高，高大环柄菇菌株EF-5的菌丝生长量呈先升后降趋势，培养8 d后菌丝生长量为0.275 0～29.925 0 mm，表现为25℃>30℃>20℃>35℃>15℃>10℃>5℃。当培养温度低于15℃时菌丝生长量缓慢增加；当培养温度超过15℃时菌丝生长量迅速提高；当温度达25℃时菌丝生长量达最高，为29.925 0 mm；继续提高培养温度，菌丝生长量呈下降趋势，当温度增至35℃时，菌丝仍能生长，但生长很慢。

2.2.2 pH 高大环柄菇菌株EF-5菌丝生长pH范围较宽，pH 4.5～11.0均能生长，随着环境pH增加，高大环柄菇菌丝生长量呈先升后降趋势，菌丝生长量为16.060 0～31.678 3 mm，表现为pH8.0>pH9.0>pH7.0>pH10.0>pH6.0>pH5.0>pH11.0>pH4.5。当pH<8.0时，菌丝生长量呈上升趋势；当pH 8.0时，菌丝生长量达最大；当pH>8.0时，菌丝生长量呈下降趋势。

2.2.3 氮源 高大环柄菇菌株EF-5在无机氮源和有机氮源培养基上均可生长，菌丝生长量为9.926 7～33.441 7 mm，表现为土豆浸粉>大豆蛋白胨>酵母膏>胰蛋白胨>蛋白胨>硫酸铵>硝酸钾>氯化铵>硝酸铵。菌丝对有机氮源的利用明显好于无机氮源。其中，菌丝在以土豆浸粉为氮源的培养基上生长最快，菌丝生长量为33.441 7 mm，显著高于除大豆蛋白胨和酵母膏处理外的其余处理；大豆蛋白胨与酵母膏处理菌丝生长量分别为31.605 0 mm和30.456 7 mm，差异不显著，但均显著高于除胰蛋白胨和蛋白胨处理外的其余处理；硝酸铵处理菌丝生长最慢，显著低于除氯化铵处理外的其余处理。

注：图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.2.4 碳源 碳源可为高大环柄菇EF-5菌丝生长提供碳元素和能量，是菌丝生长需求量最大的营养物质。高大环柄菇菌株EF-5菌丝在各种碳源培养基上均能生长，其菌丝生长量为16.038 3～32.206 7 mm，表现为糖蜜>葡萄糖>麦芽糖>纤维素>可溶性淀粉>红糖>蔗糖>乳糖。其中，以糖蜜作为碳源时的菌丝生长量最高，与其余7种碳源间差异显著，为高大环柄菇EF-5菌丝生长最佳碳源；葡萄糖和麦芽糖其次，菌丝生长量分别为32.206 7 mm和31.586 7 mm，均显著高于除糖蜜处理外的其余碳源处理；菌丝在以乳糖为碳源的培养基上生长最慢，显著低于其余碳源处理。

2.2.5 无机盐 无机盐具有维持细胞渗透压、保持细胞内酶活性等重要物质，是微生物生长必须的营养元素。高大环柄菇菌株EF-5菌丝在各种无机盐培养基上均能生长，其菌丝生长量为27.377 5～34.530 0 mm，表现为MnSO4>CaSO4>K2SO4>FeSO4>K2HPO4>Na2SO4>NaCl>CK>ZnSO4>KH2PO4>MgSO4。10种无机盐中，MnSO4、CaSO4、K2SO4、FeSO4和K2HPO4具有明显的促进菌丝生长的作用，其相互间差异不显著，但MnSO4、CaSO4和K2SO4处理菌丝生长量显著高于除FeSO4和K2HPO4外的其余处理；FeSO4和K2HPO4处理菌丝生长量显著高于除Na2SO4外的其余处理；Na2SO4处理菌丝生长量显著高于MgSO4处理，但与其余处理差异不显著；其余处理间差异不显著。在促进菌丝生长的5种无机盐中，以硫酸锰的菌丝生长量最大，菌丝最为浓密，为高大环柄菇EF-5菌丝生长最佳无机盐。

2.3 仿野生栽培

从图4看出，将高大环柄菇EF-5母种接种到二级种培养基，25℃培养大约60 d菌丝长满菌种瓶。将二级种接种到栽培料，第2天菌种即萌发，第8天基本封面，经66 d培养基本长满栽培袋，继续培养14 d进行后熟。脱袋后埋入毛樱桃林中，61 d开始陆续现蕾，菇蕾初为球形，后菌盖与膨大的菌柄基部逐渐分离，菌柄拉长将菌盖托起。当菌柄伸长，菌盖尚未展开时采收。栽培状态下的高大环柄菇EF-5可长至22 cm长，单个菇重超过100 g。

注：A为二级种，B为长满的栽培袋，C田间栽培(埋入地下)，D菇蕾，E幼菇，F采摘的成熟菇。

3 讨论

探索了高大环柄菇EF-5菌株子实体形态特征和生长条件，并通过仿野生栽培成功获得了子实体。该研究筛选出的最佳温度、氮源及发菌时间等与前人结果均有差别，究其原因是不同地区的气候、土壤不同或菌种的特性不同所致。

高大环柄菇属于新兴食用菌，相关研究刚起步，很多生物学性质并不清楚。该研究虽然成功获得子实体，但也发现在试验栽培过程中仍存在很多问题。首先，二级种生长缓慢。高大环柄菇二级种的培养时间长达60 d(750 mL菌种瓶)，远长于平菇、香菇等食用菌，且菌种培养后期产生大量黄水。其次，栽培周期长。高大环柄菇接种至栽培料到菌丝成熟需要80 d，覆土至现蕾需要61 d，从接种到现蕾的时间长达141 d，远远超过常规栽培的食用菌品种。第三，出菇条件不清楚，产量低。经过1年的试验，在实验室无法获得子实体，经仿野生栽培虽然获得子实体，但总产量较低。由于存在以上几方面的问题，高大环柄菇大规模人工栽培尚需时日。今后需进一步对二级种培养基和栽培培养基进行优化，以缩短栽培时间提高产量；同时，需要研究高大环柄菇的出菇条件和采摘条件，以实现工厂化可控栽培。

4 结论

对采自野外的1株大环柄菇属真菌(编号EF-5)通过形态学和分子生物学鉴定，最终确定其为高大环柄菇。其菌丝生长最佳条件：氮源为土豆浸粉，碳源为糖蜜，生长温度为25℃，生长pH为8，无机盐为硫酸锰。此真菌菌种在麦粒二级种培养基上的生长时间为60 d，接种栽培料后66 d长满菌袋，经仿野生栽培成功收获子实体。