织金县南瓜炭疽病菌的分离鉴定及防治药剂筛选

安星宇， 朱守殿， 黄 露， 吴石平*， 陈小均， 李 淳

(1.贵州省农业科学院 植物保护研究所， 贵州 贵阳 550006；2.黔东南州农产品质量安全检测中心， 贵州 凯里 556000)

0 引言

【研究意义】南瓜隶属于葫芦科南瓜属，又称金瓜、番瓜等，是我国最为常见的农作物之一，含有人体所需的多种营养成分，对维持人体健康具有重要作用[1]。近年来，随着南瓜饮料、南瓜籽等南瓜衍生产品越来越受到消费者的欢迎，南瓜的种植面积呈逐年增长势头。目前，我国已成为世界第一大南瓜生产国以及主要的消费国[2]。然而，随着南瓜种植面积的不断增加，各种病害也在各种植园区大量爆发，给广大种植户造成较大的经济损失。南瓜炭疽病作为主要病害，在南瓜各生长期均可发生，主要影响果实，其次影响南瓜叶片、叶柄和茎干，一般情况下减产5%～20%，严重时甚至会出现绝收的情况[3]。【前人研究进展】近年来。研究人员已对多种葫芦科作物进行了研究，并成功分离鉴定出多种炭疽病菌，肖敏等[4]鉴定出海南省黄瓜炭疽病的病原为平头炭疽菌(C.truncatum)，唐爽爽等[5]鉴定出辽宁省西瓜炭疽病的病原为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioide)，黄婷等[6]鉴定出南昌市甜瓜炭疽病的病原为瓜炭疽菌(C.orbiculare)，然而对于贵州的南瓜炭疽病病原鉴定尚未有研究报道。【研究切入点】近年来，随着织金县调整农业产业结构，大力发展南瓜产业，总种植面积已超过1万hm2，南瓜炭疽病的发生面积以及危害程度也随之逐渐加重，因而有必要对当地南瓜炭疽病进行病原鉴定，并筛选出能够有效防治该病菌的药剂。【拟解决的关键问题】通过对织金县南瓜种植区的炭疽病病样进行分离鉴定，明确当地南瓜炭疽病的病原菌，并在室内筛选出对南瓜炭疽病病原菌防效较好的杀菌剂，为南瓜炭疽病的科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 南瓜病样 采集于织金县南瓜种植区，存放于4℃冰箱。

1.1.2 培养基 水琼脂(WA)培养基：琼脂粉15 g，水1 L，自然PH，121℃下灭菌20 min，倒入灭过菌的培养皿中，备用；马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200 g，葡萄糖18 g，琼脂粉18 g，水1 L，自然PH，121℃下灭菌20 min，最后倒入灭过菌的培养皿中，备用。

1.1.3 引物 依据前人的研究[7]，合成引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)、ACT-512F(5′-ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC-3′)/ACT-783R(5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCAT-3′)、GAPDH-F(5′-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3′)/GAPDH-R(5′-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3′)。

1.1.4 药剂 市场上常见的8种杀菌剂：60%唑醚·代森联 WG，巴斯夫(中国)有限公司；10%苯醚甲环唑 WG，利民化学有限责任公司；30%肟菌酯 SC，杭州宇龙化工有限公司；1%申嗪霉素 SC，上海农乐生物制品股份有限公司；450 g/L咪鲜胺 EW，福建新农大正生物工程有限公司；70%丙森锌 WP，拜耳(中国)有限公司；22.5%啶氧菌酯 SC，杜邦中国集团有限公司；50%嘧菌酯 WG，江阴苏利化学股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分离病原 参照黄露等[8]的分离方法，在显微镜下，挑取病样上的分生孢子器置于灭菌水中，用力压碎后，制成孢子悬浮液，然后用移液枪吸取孢子悬浮液到水琼脂培养基上涂布。2 d后，通过显微观察，将已经萌发的孢子转移至PDA培养基上，密封后置于25℃培养箱中培养，最后进行纯化，并分别保存于4℃及-80℃冰箱中。

1.2.2 致病性鉴定 按照科赫式法则，将分离纯化后的病原菌进行回接，观测是否出现相同的发病症状。首先将待测菌株在PDA培养基上进行活化，在菌落边缘打取直径为5 mm的菌块，并打取空白的培养基；用无菌水将健康的南瓜清洗干净，将菌块的菌丝面朝下，贴于南瓜上的接种点，相同方法接种空白PDA作为对照。26℃保湿培养，每天观察发病症状，并对发病部分进行分离培养，再次进行病原鉴定。

1.2.3 病原菌的鉴定 通过CTAB法提取菌株DNA。分别使用引物对rDNA的ITS、CAT、GAPDH序列进行扩增。PCR产物经过1%琼脂凝胶电泳检测后，送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行序列测定。参照崔晓霞等[9]的分析方法，对分离纯化菌株及参考模式菌株的ITS基因序列进行编辑，采用MEGA 7.0以邻接法进行系统发育树构建与聚类分析。将比较结果与病原菌的形态特征结合，对病原菌进行分析与鉴定。

1.2.4 室内药剂筛选 参考李树江等[10]的方法，以市场上常见的8种杀菌剂进行药剂筛选，设8个处理，每种药剂1个处理，T1～T8处理分别为60%唑醚·代森联WG、10%苯醚甲环唑WG、30%肟菌酯SC、1%申嗪霉素SC、450 g/L咪鲜胺EW、70%丙森锌WP、22.5%啶氧菌酯SC、50%嘧菌酯WG。将各药剂加入到已灭菌的PDA中混匀，配制成4 000倍液的药剂培养基，倒入培养皿中，以不含药剂的PDA为对照，每个处理3次重复。用打孔器在培养6 d后的菌株菌落边缘打取直径为5 mm的小菌块，将菌丝面朝下接种到含药平板和对照平板中央，用封口膜密封后，置于28℃恒温培养箱中培养6 d，采用十字交叉法测定不同处理的菌落直径，计算抑菌率，并通过DPS对杀菌剂的抑菌效果进行差异显著性分析。

抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌块直径)]×100%

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离纯化及形态观察

由图1显示，南瓜病样上的病斑为圆形或椭圆形，坏死区为黑色，当湿度较高时，黑色病斑上出现大量白色菌丝。通过单孢分离法对南瓜炭疽病病样进行病菌分离，得到N-1和N-2共2个菌株。其分生孢子为单孢子，没有隔膜、壁光滑，椭圆形或肾形，直或稍弯曲，两端为钝圆，大小一般为(4～7)μm×(12～23)μm，其形态与DU等[11]从百香果炭疽病病样分离到的Colletotrichumbrevisporum相似，因而初步鉴定该病菌为C.brevisporum。

注：A为发病症状；B为产孢结构；C为分生孢子(标尺为20 μm)。

2.2 分离菌株的致病性鉴定

人工离体接菌后南瓜的发病症状与自然发病症状基本一致，首先在接种处出现水渍状斑点，后变成暗褐色凹陷斑，逐渐扩大形成暗褐色的圆形或椭圆形病斑，中心坏死区为黑色，且黑色病斑上有大量白色菌丝，而对照则不发病(图2)。对发病组织进行病原菌分离，得到与接种前形态一致的病原菌，表明，菌株N-1和菌株N-2确实为引起南瓜炭疽病的病原菌。

注：A为离体接种发病症状；B为对照。

2.3 分离菌株的分子鉴定

从图3看出，菌株N-1和菌株N-2的总DNA通过引物ITS1/4、CAT-512F/783R和GAPDH-F/R进行PCR扩增，分别得到长度约为500 bp的ITS片段、长度约为250 bp的ACT和GADPH片段。在NCBI数据库上对扩增产物序列进行对比发现，分离得到的菌株为炭疽菌属(Colletotrichum)真菌，因而选用11个炭疽菌菌株使用MEGA 7.0采用邻接法构建系统发育树(图4)。从南瓜病样上分离得到的病菌菌株N-1和菌株N-2与C.brevisporum菌株GM1、CPDZ21、COUFAL7300及UACH289聚在一起，支持率为100%。结合形态学观察，确定引起织金县南瓜炭疽病的病原为C.brevisporum。

注：A为rDNA-ITS PCR扩增电泳图；B为ACT PCR扩增电泳图；C为GAPDH PCR扩增电泳图谱。

图4 基于ITS、ACT及GADPH序列构建的系统发育树

2.4 不同杀菌剂对南瓜炭疽病菌的抑制效果

由表1可知，8种杀菌剂均对南瓜炭疽病有一定的抑制作用，但不同药剂之间存在差异。南瓜炭疽病菌在8种杀菌剂4 000倍液药剂培养基上的菌落直径为9.5～42.5 mm，均较CK(57.7 mm)小，其中，T1、T2及T5的菌落直径在10.0 mm左右，明显低于其余药剂处理和CK；8种药剂处理的抑菌率为28.8%～91.5%，其中，T1、T2及T5的抑菌率均超过88.0%，抑制效果极显著高于其余5种药剂处理，三者间差异不显著；其次为T3(60.2%)和T8(58.8%)，二者差异不显著，但T3极显著高于T7、T6和T4，T8显著高于T7，极显著高于T6和T4；T7(49.1%)和T6(44%)差异不显著，但均极显著高于T4；T4的抑制效果最差，仅为28.8%。表明，60%唑醚·代森联WG、10%苯醚甲环唑WG以及450 g/L咪鲜胺EW是防治南瓜炭疽病较好的化学药剂。

表1 8种杀菌剂对南瓜炭疽病的抑制效果

3 讨论

炭疽病菌是一类危害严重的植物病原菌，其部分菌株能够侵染南瓜等多种葫芦科作物，并能在瓜类作物的整个生长期发生，严重影响农作物的产量与品质[12]。炭疽病主要由炭疽菌属(Colletotrichum)中的真菌引起，因植物不同，其病原菌也有所不同。近年来，分子生物学研究取得了很大进展，可采用内转录间隔区(ITS )、肌动蛋白( ACT )、3 -磷酸甘油醛脱氢酶( GADPH )等基因序列的多基因系统发育分析法，对植物炭疽菌分子鉴定以及分类。LIU等[13]通过ITS、GAPDH、ACT及TUB2基因序列分析，从吉林省的南瓜炭疽病病样上分离得到C.brevisporum。本研究从采自贵州织金县南瓜种植区的病样中分离得到的病原菌，经形态学结合分子生物学鉴定以及致病性测定，确定其病原菌为C.brevisporum，这说明C.brevisporum在我国东北地区及西南地区均为造成南瓜炭疽病的病原菌。

该研究针对南瓜炭疽病菌选用市场上常见的8种杀菌剂进行室内筛选，结果表明60%唑醚·代森联WG、10%苯醚甲环唑WG及450 g/L咪鲜胺EW对C.brevisporum有较强抑菌作用。与室内直接比较杀菌剂与病菌的互作不同，在实际使用中，药剂的抑制效果还受温度、湿度等环境因素的影响，因此，可将60%唑醚·代森联WG、10%苯醚甲环唑WG及450 g/L咪鲜胺EW作为候选药剂，在田间进行进一步的效果测定，为南瓜炭疽病的防治提供科学依据。

4 结论

通过对分离得到的病原菌进行形态学观察，并利用ITS、ACT、GADPH基因序列对病原菌进行扩增及测序，明确了引起贵州织金县南瓜炭疽病的病原菌为C.brevisporum。通过室内药剂筛选发现，60%唑醚·代森联WG、10%苯醚甲环唑WG及450 g/L咪鲜胺EW对南瓜炭疽病菌C.brevisporum具有较好的抑制作用，抑菌率为88.6%～91.5%，可用作南瓜炭疽病田间防治候选药剂。