基于16S rDNA高通量测序探讨高铜对肉鸡盲肠微生物多样性的影响

白雨曼，李鑫润，廖建昭，刘德琴，霍海花，王书舟，杨 帆，马飞洋, 唐兆新*，郭剑英* (.华南农业大学 兽医学院，广东 广州 5064；.江西农业大学 动物群发性疾病监测与防控研究所，江西 南昌 330045)

铜(Cu)是动物机体的必需微量元素，在生物体的细胞呼吸、神经递质传递、抗氧化应激和铁离子的摄取等许多重要生理过程起着重要的作用[1]。但过度的铜摄入会引起各器官出现氧化应激、炎症反应、代谢紊乱等问题[2-4]，影响其正常功能作用甚至损伤器官。肠道菌群的多样性能够保证肠道微生物区系平衡，维持胃肠道环境相对稳定，促进营养物质消化吸收[5]。肠道铜稳态具有博弈性，一方面,铜是多种氧化还原酶的辅助因子并参与肠道细胞有氧呼吸、其他金属元素的代谢过程：另一方面,过量的铜通过催化芬顿反应产生的超阴负离子与过氧化氢合成有毒的羟基自由基[6]。因此对白羽肉鸡进行高铜日粮饲喂所导致的肠道铜稳态紊乱，可以很大程度影响机体对脂质和蛋白质的吸收和代谢，BELIZARIO等[7]认为肠道菌群的丰度和多样性是正常代谢和免疫功能的体现。而鸡肠道中微生物最活跃的器官是盲肠，从小肠下行的物质约有10%进入盲肠[8]。本试验利用Illumina MiSeq测序平台，对对照组和高铜组中白羽肉鸡盲肠内容物中微生物16S rDNA V4区序列进行测定，并对其菌落结构多样性和丰度进行分析，结合其代谢通路预测以及组织学观察，探究高铜日粮的摄入对肉鸡盲肠及其微生物的影响，以期为高铜对肉鸡毒理学相关研究提供一定的生物学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及处理1日龄艾拔益加(AA)商品代白羽肉鸡120羽(平均体质量43 g)，购自广东省东莞市塘厦镇。肉鸡采用笼养方式养殖，饲养过程中所有肉鸡均进行常规免疫，肉鸡自由饮水和采食。本试验选用无水硫酸铜作为铜源，基础日粮的铜含量按照NRC(1994)建议的11 mg/kg，另外根据YANG等[9]的研究设置高铜日粮组，含铜量为330 mg/kg(高铜组)。在其他条件相同下饲喂至49日龄经翅静脉注射戊巴比妥钠麻醉后，剖开腹腔并采集盲肠及盲肠内容物，一部分盲肠经液氮速冻后转入-80℃保存，另一部分采用4%多聚甲醛溶液进行组织固定，盲肠内容物经液氮速冻后转入-80℃保存，送至上海烈冰生物医药科技有限公司进行测序。

1.2 主要试剂无水硫酸铜(分析纯)购自天津市大茂化学试剂厂；肉鸡全价基础饲料购自广州花都某饲料厂；多聚甲醛(paraformaldehyde)购自Sigma公司；切片石蜡、中性树胶购自国药集团公司；TRIzol、PrimeScript RT Master Mix购自TaKaRa公司；2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 样本组织总铜检测取盲肠组织100 mg，用浓硝酸与过氧化氢在沸水浴的作用下，对组织消解30 min直至液体澄清透明，消化冷却至室温。样品消化后过滤到50 mL容量瓶中，用5%稀硝酸定容，摇匀，待测。采用电感耦合等离子体质谱ICP-MS火焰分析法分析铜的含量，铜的测定线为324.75 nm，火焰类型为空气-乙炔焰。将铜元素标准储备液进行梯度稀释制备标准液，通过原子吸收仪测定标准液的吸光值以制作标准曲线。待测样品所测得的吸光值根据标准曲线计算得出样品的铜浓度。

1.4 样本病理组织观察取新鲜盲肠组织经生理盐水轻缓冲洗之后，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h 后，经流动自来水冲洗过夜，进行梯度酒精脱水、透明、透蜡和石蜡包埋，待蜡块自然凝固之后。进行切片、苏木精-伊红染色、中性树脂封片，光学显微镜观察盲肠组织的病理学变化。

1.5 盲肠内容物高通量测序检测将样本送至上海烈冰生物医药科技有限公司进行测序：首先提取盲肠内容物组样本DNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对样本进行16S rDNA的V4区域 PCR扩增，并构建PE扩增文库。对Illumina NovaSeq 测序得到的下机数据(Raw PE)进行拼接和质控，得到Clean Tags，再进行嵌合体过滤，得到可用于后续分析的有效数据。为研究各样本的物种组成，对所有样本的Effective Tages以97%的一致性进行Operational Taxonomic Units(OTUs)聚类，然后对OTUs的序列进行物种注释。最后对盲肠内容物中微生物群落结构、多样性、蛋白功能及代谢通路功能的变化进行预测分析。

1.6 数据分析用Office Excel软件将处理好的数据进行整理和统计，并用SPSS软件对数据进行单因素方差分析以及差异显著性检验和多重比较。用GraphPad Prism 6.0软件作图。*表示P<0.05(差异显著)，**表示P<0.01(差异极显著)。

2 结果

2.1 日粮中铜含量不同对肉鸡盲肠中铜含量的影响如图1所示，与对照组相比，高铜组盲肠中铜含量极显著升高(P<0.01)。

与对照组相比，*表示 P<0.05，**表示P<0.01。下同图1 日粮中铜含量不同对肉鸡盲肠中铜含量的影响

2.2 高铜对肉鸡盲肠组织学变化的影响结果显示，盲肠组织并未发生明显的病变(图2)；由图3可见，与对照组相比，高铜组盲肠绒毛高度显著降低(P<0.05)，隐窝深度显著增高(P<0.05)，绒毛高度与隐窝深度比值极显著降低(P<0.01)。

A.对照组；B.高铜组图2 盲肠的组织学形态 (400×)

A～C.分别为肉鸡盲肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度和隐窝深度的比值图3 高铜日粮对肉鸡盲肠结构的影响

2.3 16S rDNA测序结果结果显示，共从盲肠内容物中获得有效序列490 872条，其中487 610条高质量序列，149 88个OTUs，满足后续试验数据分析要求。

2.4 Alpha Diversity分析Alpha多样性(样本内多样性)是指一个特定区域或生态系统内的多样性，常用的度量指标有Chao1 丰富度估计量(chao1 richness estimator)、香农-威纳多样性指数(shannon-wiener diversity index)、辛普森多样性指数(simpson diversity index)等。测量数据如表1所示，对照组与高铜组的样品丰度和多样性相差不大，但高铜组菌种的多样性相比对照组有明显的下降趋势。

表1 多样性指数

如图4所示，Chao1曲线表明所测样品中预测物种多样性很多；当Shannon指数为5～7时，Simpson指数为0.9～1.0时，曲线趋于平缓，表明各样本从随机抽取的测序条数发现的物种趋于饱和，即检测到了近乎全部的OTUs。数据可靠且全面。

横坐标均为随机抽取的序列数图4 样品Chao1曲线(A)、Shannon曲线(B)和Simpson曲线(C)

2.5 高铜在门水平上对肉鸡盲肠微生物多样性的影响试验进行49 d时，饲喂高铜日粮在门水平上对肉鸡盲肠微生物多样性的影响如图5所示，即与对照组相比，高铜组中的柔膜菌门(Tenericutes)含量显著升高(P<0.05)，而厚壁菌门(Firmicutes)细菌的含量显著降低(P<0.05)。

图5 试验49 d基于门水平高铜组与对照组的比较

2.6 高铜在科水平上对肉鸡盲肠微生物多样性的影响试验进行49 d时，饲喂高铜日粮在科水平上对肉鸡盲肠微生物多样性的影响如图6所示，与对照组相比，高铜组中的红螺菌科(Rhodospirillaceae)含量极显著升高(P<0.01)，同时肠杆菌科(Enterobacteriaceaae)含量显著升高(P<0.05)；而韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)细菌的含量显著降低(P<0.05)。

图6 试验49 d基于科水平高铜组与对照组的比较

2.7 高铜对肉鸡盲肠微生物(属水平)的影响试验进行49 d时，饲喂高铜日粮在属水平上对肉鸡盲肠微生物多样性的影响如图7所示，与对照组相比，高铜组中的另枝菌属(Alistipes)含量显著升高(P<0.05)；而厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)，瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)细菌的含量却显著降低(P<0.05)。

图7 试验49 d基于属水平高铜组与对照组的比较

2.8 高铜对肉鸡盲肠微生物代谢通路的影响KEGG分析如图8所示，试验49 d，饲喂高铜日粮对肉鸡盲肠微生物代谢通路产生的影响，高铜组与对照组相比蛋白所参与到的32个代谢通路因子有显著性差异(P<0.05)，高铜组与氧化磷酸化相关的p53信号通路(p53 signaling pathway)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)及与营养代谢相关的甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(glycine,serine and threonine metabolism)、脂肪酸代谢(fatty acid metabolism)、蛋白质外排(protein export)、DNA修复和重组蛋白(DNA repair and recombination proteins)等代谢通路因子显著升高(P<0.05)；但矿物质吸收(mineral absorption)、D-丙氨酸代谢(D-alanine metabolism)、蛋白激酶(protein kinases)、苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)等通路因子显著降低(P<0.05)。结果表明，饲喂高铜日粮会改变肉鸡盲肠菌群代谢通路因子。

图8 高铜组与对照组样品微生物KEGG的比较

3 讨论

铜是动物机体的必需微量元素之一，其参与机体多种生理生化过程[10]。在饲料中添加铜可促进畜禽生长，农业生产中常用其作为饲料添加剂使用，但铜摄入过量会对机体造成危害。近年，由于重金属排放问题的加重以及农业生产中滥用越发明显，铜对环境、农业污染的报道屡见不鲜[11-12]。前期研究表明，摄入高铜会诱发肉鸡的肝脏以及消化器官不同程度的损伤[13-15]。肠道作为禽类消化最集中的部位，主司食物消化和吸收功能，盲肠微生物菌群的构建时间相对来说较为延后，大概在生长发育6～7周后完成构建。食物进入消化道，经一系列消化过程，最终在盲肠和直肠停留，此处的细菌数量巨大[16]。日粮中的铜被肠道吸收后会以铜蓝蛋白形式滞留在肠道中，并结合蛋白小分子转运到其他系统器官中，而超过吸收范围的小部分铜就存蓄在肠道黏膜细胞中[17]，剩余部分将随粪便排出体外。本研究对盲肠组织中总铜含量检测发现，高铜组组织铜含量相比对照组显著升高，说明铜能滞留在盲肠组织中。

动物消化道存在着数目庞大且种类丰富的微生物，这些微生物组成的群落在动物的营养、免疫、生理和代谢等方面发挥着巨大作用[18]。肠道内微生物是环境依赖型[19],因此肉鸡盲肠内微生物丰度的改变可能由盲肠结构变化导致。肠绒毛高度、隐窝深度以及两者的比值是评价畜禽发育、营养水平的一个指标[20]，绒毛越高说明肠上皮细胞发育程度越完整，对营养物质的吸收能力越强；隐窝则代表上皮细胞成熟率，越浅代表成熟率越高；两者的比值降低代表消化功能降低[21]。在现有的研究背景下，铜对肠道绒毛形态的影响结论不一，SHURSON等[22]认为高铜可以增加隐窝深度。王艳华[23]却提出纳米铜和高水平硫酸铜能够增加断奶仔猪肠绒毛高度。而RADECKI等[24]研究表明，饲喂250 mg/kg硫酸铜不会对断奶仔猪肠绒毛高度、隐窝深度产生明显影响。本试验中高铜组与对照组相比，盲肠绒毛高度有所下降，且隐窝深度也有所增加，而绒毛高度与隐窝深度的比值显著下降。这说明饲喂高铜日粮会改变盲肠的肠道结构，并可导致肉鸡对食物消化吸收的能力降低。

铜虽然可以促进动物的生长，但随着铜的不断摄入并在肠道蓄积，将会改变肠道菌群的组成使肠道内菌群失衡。ZHANG等[25]研究发现铜的摄入改变了盲肠微生物群落的组成，增加了肠道大肠杆菌的抗药性，并且可能在断奶后早期损害仔猪的健康。本研究通过 Illumina-Hiseq 高通量测序平台对对照组及高铜组的 12 羽白羽肉鸡的盲肠内容物进行 16S rDNA 测序共得 10 个菌门，12 个菌科，74 个菌属。结果显示，高铜组肉鸡的盲肠内微生物门水平以厚壁菌门、拟杆菌门为主；属水平以另枝菌属、瘤胃球菌属 UCG-014、链球菌属等为主,其中仍以另枝菌属所占丰度最高，占 21%。据林奕岑等[26]报道肉鸡盲肠中优势菌门为拟杆菌门(70%)，厚壁菌门(25.4%)，这与本试验中高铜结果相反：厚壁菌门占优势(75%)，拟杆菌门(22.67%)，而拟杆菌门下的另枝菌属及厚壁菌门下的瘤胃球菌属等作为肉鸡盲肠的优势菌属鲜少报道。这表明高铜的摄入可能导致盲肠菌群的紊乱。相关研究显示，肠道菌群在营养吸收、免疫系统以及生殖功能等方面承担相应的作用。XU等[27]对结肠癌研究中提到，肠道微生物的组成变化会引起机体代谢状态的变化。CLAVEL等[28]对肠道微生物代谢组学的研究发现，当肠道菌群中益生菌优势时，肠道中丙酸和丁酸等菌群代谢物的浓度就会增加，这些代谢物会提升免疫细胞的活性。本试验利用 KEGG代谢通路分析显示，与对照组相比高铜组肉鸡肠道菌群在矿物质吸收、D-丙氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、蛋白激酶、细菌运动性蛋白质的代谢通路因子降低。这些通路因子改变，共同影响了肉鸡对矿物质、蛋白质、脂肪的吸收和能量的转化。这表明高铜的摄入影响菌群的同时也可能会改变其代谢通路及水平。

综上所述，高铜日粮的摄入会导致铜滞留在肉鸡盲肠内，蓄积的铜会影响盲肠组织结构，可能导致其营养吸收转化效率降低。此外，铜的过度添加可能影响其内部肠道菌群的组成以及代谢通路；因此建议按照《饲料添加剂安全使用规范》中推荐剂量(4～11 mg/kg)的最高剂量添加，基本不会影响肉鸡盲肠组织结构或菌群组成，也能其满足生长需求。