宫颈癌组织中长链非编码RNA ZNF667-AS1的表达及临床意义

胡 萃，刘 双

湖南省妇幼保健院妇产科，湖南长沙 410008

宫颈癌的发病率呈逐年升高趋势，且呈年轻化发展，有研究显示，宫颈癌患者术后仍存在较高的复发风险，严重影响患者预后[1-2]。因此，寻找宫颈癌临床诊断标志物具有重要意义。长链非编码RNA(lncRNA)是一类不编码蛋白质的RNA，其参与调控基因表达[3]。临床研究显示，lncRNA在宫颈癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中呈异常表达[4-5]。ZNF667-AS1为新近发现的一种lncRNA，其对肿瘤细胞周期及细胞迁移有一定影响[6]。有文献报道，鼻咽癌组织中lncRNA ZNF667-AS1的表达下调，其可能影响鼻咽癌细胞的生物学行为[7]。本课题组前期通过芯片技术发现，宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1表达异常。因此，本研究对比分析了宫颈癌组织、癌旁组织、正常宫颈组织中lncRNA ZNF667-AS1的表达，并探讨其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2020年12月本院收治的80例宫颈癌患者纳入研究，年龄39～71岁，平均(51.72±4.19)岁。纳入标准：(1)均经临床病理检查确诊，且均为首次发病；(2)术前均未接受放化疗治疗。排除标准：(1)合并严重心、肝、肾等脏器功能异常者；(2)术前接受激素治疗者；(3)合并严重感染性疾病者。另选取行全子宫切除术的80例子宫肌瘤患者作为对照，均经临床病理检查确诊，年龄36～72岁，平均(50.68±3.75)岁。宫颈癌患者与子宫肌瘤患者年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理学委员会审批，入组患者均对本研究知情同意，并签订知情同意书。

1.2仪器与试剂 LEPGEN-96实时荧光定量PCR仪由北京乐普医疗科技公司提供；紫外可见超微量分光光度计由南京菲勒公司提供；Trizol试剂盒购自杭州新景生物公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自上海联迈生物公司；lncRNA ZNF667-AS1及内参β-ACTIN引物委托上海生工生物公司合成。

1.3方法

1.3.1标本收集 收集宫颈癌患者术后癌组织及对应癌旁组织(距癌组织边缘≥2 cm)，收集子宫肌瘤患者术后正常宫颈组织，新鲜组织标本经液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱中待检。

1.3.2lncRNA ZNF667-AS1检测方法 总RNA提取：分别取50 mg宫颈癌组织、癌旁组织、正常宫颈组织标本超声匀浆，应用Trizol试剂盒提取总RNA，经焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后检测RNA的完整性，RNA的纯度和浓度应用光度计检测。逆转录反应：反应体系20 μL，按照试剂盒说明书操作，总RNA 1 μL，RNA酶抑制剂0.19 μL，上、下游引物各3 μL，dNTPs 0.15 μL，MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μL，10×RT buffer 1.5 μL，加DEPC水补至20 μL。反应条件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，90 ℃ 5 min，4 ℃ 1 min，产物置于4 ℃保存。lncRNA ZNF667-AS1上游引物为5′-GCTGGAAGCACAGAGATGAG-3′，下游引物为5′-CGTAGTAAGCGCCACGACTG-3′，β-Actin上游引物为5′-GCGGACTACTGGCTCACTAC-3′，下游引物为5′-ACTCATCTGTCTGCCTGATT-3′。PCR扩增：反应体系20 μL，按照试剂盒说明书操作，cDNA 1 μL，TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，双蒸水7 μL。反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共40个循环。

1.3.3结果计算 每组设3个复孔，分别计算各标本平均循环阈值(Ct值)，根据公式2-ΔΔCt，计算lncRNA ZNF667-AS1的相对表达量。

2 结 果

2.1组织标本中lncRNA ZNF667-AS1的相对表达量分析 宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1的相对表达量，明显低于癌旁组织及正常宫颈组织，差异均有统计学意义(t=33.501、31.658，P<0.01)；癌旁组织中lncRNA ZNF667-AS1的相对表达量低于正常宫颈组织，但差异无统计学意义(t=1.689，P=0.931)，见图1。

2.2不同临床特征宫颈癌患者lncRNA ZNF667-AS1相对表达量比较 在不同FIGO分期、分化程度及淋巴结转移情况的宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1的相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床特征宫颈癌患者lncRNA ZNF667-AS1相对表达量比较

续表1 不同临床特征宫颈癌患者lncRNA ZNF667-AS1相对表达量比较

2.3lncRNA ZNF667-AS1诊断宫颈癌的ROC曲线分析 ROC曲线分析显示，lncRNA ZNF667-AS1诊断宫颈癌的曲线下面积为0.834(95%CI：0.739～0.968)，诊断灵敏度为92.35%，特异度为81.12%。

3 讨 论

随着临床研究的深入，lncRNA参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移等热点问题受到临床关注[8]。lncRNA与某些特定疾病密切相关，其在某些恶性肿瘤细胞中表达异常，或将成为临床恶性肿瘤诊疗的潜在标靶[9-10]。既往研究显示，lncRNA LINC01503[11]、lncRNA NPPA-AS1[12]等lncRNA均与宫颈癌发生及进展密切相关。ZNF667-AS1基因是ZNF667基因的反义链，位于19q13.43染色体上，其在结肠腺瘤、乳腺癌等多种肿瘤中存在表观遗传学沉默[13]。本课题组前期通过芯片技术发现，lncRNA ZNF667-AS1在宫颈癌组织中表达异常。

本研究发现，宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1的相对表达量明显低于癌旁组织及正常宫颈组织，提示宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1的低表达可能与宫颈癌发病有关，lncRNA ZNF667-AS1可能发挥抑癌作用。郑杰等[14]研究发现，下调lncRNA ZNF667-AS1的表达可抑制胶质瘤细胞的转移及侵袭。吴璇等[15]研究报道，食管鳞状细胞癌组织中lncRNA ZNF667-AS1表达明显降低，其表达水平与肿瘤组织TNM分期及分化程度有关。

本研究结果发现，不同FIGO分期、分化程度及淋巴结转移情况的宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1的相对表达量差异明显，且FIGO分期越高、分化程度越低、发生淋巴结转移的宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1表达越低。因高FIGO分期、低分化是肿瘤恶性生物学行为的表现，淋巴结转移是预后不良的指标，故推测lncRNA ZNF667-AS1低表达可能是预测宫颈癌患者预后不良的潜在指标。有学者研究报道，ZNF667-AS1在喉癌组织中表达下调，且其低表达与喉癌组织的病理分化程度相关，下调ZNF667-AS1的表达可增强AMC-HN-8和TU177细胞的增殖、迁移、侵袭能力[16]。另有文献报道，lncRNA ZNF667-AS1在结直肠癌组织中表达下调，其可通过调节ANK2/JAK2的表达，进而抑制结直肠癌的进展[17]。由以上研究可知，lncRNA ZNF667-AS1与多种恶性肿瘤的发生及发展相关。通过ROC曲线分析发现，lncRNA ZNF667-AS1诊断宫颈癌的曲线下面积为0.834(95%CI：0.739～0.968)，诊断的灵敏度为92.35%，特异度为81.12%。因此，推测lncRNA ZNF667-AS1可作为宫颈癌临床诊断的生物标志物。

综上所述，宫颈癌组织中lncRNA ZNF667-AS1呈低表达，其表达水平与FIGO分期呈负相关，可作为预测宫颈癌的生物学标志物及潜在治疗靶标，但相关机制还有待进一步研究。