微流控技术在急诊降钙素原检测中的应用*

金 宁，朱 驰，马 俊

同济大学附属东方医院检验科，上海 200120

降钙素原(PCT)是诊断细菌感染的理想生物标志物[1],不仅可用于感染性和非感染性疾病的鉴别，而且在感染性疾病的早期诊断、病情评估和合理用药方面均具有一定的指导意义[2]。目前对PCT定量测定的方法包括放射免疫分析法、免疫荧光法、双抗体夹心免疫化学发光法、酶联免疫吸附测定法(酶免法)等[3]，其中罗氏诊断生产的PCT检测试剂盒(电化学发光法)在全自动电化学发光免疫检测仪上实现了PCT检测的自动化和快速化，干扰因素少，可满足临床检测需求[4]。但是，罗氏电化学发光法要求标本必须来源于静脉血，且通常为批量上机检测，报告时间相对较长，不适合用于急诊的即时检测和儿科门急诊的末梢血检测[5]。因此，一种可利用末梢血检测PCT的即时检测技术的应用迫在眉睫。微流控技术是微尺度下的流体控制，其研究对象是微米级通道操控纳升级以下微量液体的系统，而体外诊断是典型的流体操控过程，不仅需要操作便利，而且要求分析结果准确，因此，微流控芯片的应用是体外诊断技术发展和进步的重要途径[6]。本文将PCT的新型微流控检测技术与常规的罗氏电化学发光法比较，验证微流控技术在PCT临床检测中的可行性，以期为临床提供一种快速、准确、标本类型多样的PCT即时检测方法，从而降低急诊检验的报告时间。

1 材料与方法

1.1标本来源 标本来源自2019年5月7-21日在本院进行PCT检测的门诊和住院部疑似细菌感染、有早期脓毒血症症状的患者。

1.2标本采集 全血和血浆采集：采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝采血管采集静脉血，离心分离后取血浆。血清的收集：采血后尽快以3 000 r/min离心10 min，分离血清。末梢血的采集：用一次性采血针穿刺无名指，将血液收集在0.5 mL EDTA-K2抗凝离心管中。在标本入组时排除重复检测的病例标本，采用以上方法共收集140例患者的血浆标本，其中67份为与血浆标本来自同一患者的全血标本(同源全血)，69份为与血浆标本来自同一患者的血清标本(同源血清)，以及26份为与血浆标本来自同一患者的末梢血标本(同源末梢血)，合计302份标本。全部标本的检测均在采集当天完成。

1.3方法 实验方法：采用上海速创诊断产品有限公司生产的PCT测定试剂盒(免疫荧光法)及配套MI300型号干式荧光免疫分析仪。主要反应原理是将PCT荧光标记检测抗体、PCT捕获抗体和非特异性抗体分别固定在微流控检测卡的通道内，待检标本在通道内流动中分别完成与荧光标记的检测抗体和捕获抗体的反应，反应结束后通过短时离心去除废液，读取检测反应区荧光信号自动拟合标准曲线算法后可得到标本中PCT的水平。对照方法：采用罗氏诊断生产的PCT检测试剂盒(电化学发光法)及配套Cobas e411型电化学发光分析仪。采用双抗体夹心二步法，待检标本与生物素化的单克隆PCT抗体以及钌复合物标记的单克隆PCT抗体一起孵育，形成抗原抗体夹心复合物；加入包被链霉亲和素的磁珠微粒进行孵育，复合体与磁珠通过生物素和链霉素的作用结合；通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面，给电极加一定的电压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度，发光强度与PCT水平成正比。试验方法与对照方法均严格按照说明书进行操作，实验前各自进行校准和质控，以保证检测结果的可靠性。

1.4统计学处理 相关性分析：对2种方法检测结果及实验方法中不同标本类型的检测结果做相关分析和回归分析，r≥0.975或r2≥0.95则可认为选择的数据范围适合，数据满足要求。偏倚分析：采用Bland-Altman方法，以2种方法测定结果的均值作为X轴、差值为Y轴，计算所有差值的平均值(A)及标准差(SD)，并根据公式A±1.96SD得到覆盖95%CI的一致性界限，根据一致性界限统计离群值和离群值比例。相对灵敏度、相对特异度和总体符合率：以对照方法检测结果作为金标准，计算实验方法检测结果在医学决定水平0.5 ng/mL和2.0 ng/mL的相对灵敏度和相对特异度，并应用 Kappa一致性检验判定两种检测方法的一致性。以Kappa值≥0.75表示一致性较好，0.40≤Kappa值<0.75 表示一致性一般，Kappa值<0.40表示一致性较差。

2 结 果

2.1相关性及偏倚分析 对照方法检测血浆和实验方法检测血浆、同源全血、同源血清和同源末梢血结果两两比较，得到的一元回归方程和线性相关系数r2见表1。通过分析，2种方法间及实验方法不同标本类型间r2≥0.975，表明相关性较好。对照方法检测血浆和实验方法检测血浆、同源全血、同源血清、同源末梢血结果的Bland-Altman分析显示，对照方法检测血浆与实验方法检测血浆、同源全血、同源血清、同源末梢血结果计算平均偏倚分别为-0.29、-0.21、-0.14、 -0.11 ng/mL，一致性界限为-3.30～2.71、-3.33～2.92、-1.07～0.80、-1.37～1.16 ng/mL，离群值比例分别为9/140、5/67、5/69、3/26。实验方法血浆与同源全血、同源血清、同源末梢血结果计算平均偏倚分别为0.32、0、0.23 ng/mL；一致性界限为-1.60～2.23、-0.68～0.68、-1.48～1.94 ng/mL，离群值比例分别为4/67、4/69、2/26。结果显示，对照方法与实验方法间、实验方法检测不同标本类型间一致性较好，离群点个数占总体标本比例在合理范围内。

表1 对照方法和实验方法的一元回归方程和线性相关系数

2.2一致性统计结果 以0.5 ng/mL和2.0 ng/mL为医学决定水平进行统计分析，分别计算实验方法相对于对照方法的相对灵敏度和相对特异度，结果见表2、3。结果显示，实验方法检测血浆、同源全血、同源血清的相对灵敏度和相对特异度均较高，Kappa值均>0.75，实验方法和对照方法一致性较好。

表2 以0.5 ng/mL为医学决定水平的相对灵敏度、相对特异度和Kappa值

表3 以2.0 ng/mL为医学决定水平的相对灵敏度、相对特异度和Kappa值

3 讨 论

脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍，其病情进展快、病死率高、后遗症多发，早期诊断并及时治疗可提高患者生存率以及改善预后[6]。PCT是临床评估感染严重程度和脓毒症的重要生物标志物，在严重细菌感染或脓毒症时，PCT比其他炎性因子出现得早，且不受其他非炎症指标干扰[7]，在临床检测中已广泛应用，且效果较好[8]。PCT检测方法较多，常用罗氏电化学发光法对标本PCT水平进行分析，这类检测方法具有自动化程度高和检测精密度高的特点，但标本类型要求为静脉血，且处理及检测耗时较长，不能够满足临床快速获取可靠检测结果的需求[9]。在此背景下，采用末梢血全血进行PCT检测备受关注[10]。与电化学发光法比较，微流控技术具有标本使用方便、标本消耗量少、出报告时间短等特点，适用于儿科和门、急诊等即时检测需求，可帮助临床对感染性疾病进行快速诊断与鉴别诊断，极大地满足临床检测要求。

本研究主要分析新型微流控技术检测不同标本类型中PCT水平与罗氏电化学发光法检测是否一致，并评估了微流控技术检测不同标本类型中的PCT水平间的相关性和偏倚。罗氏电化学发光法检测标本为血浆，而微流控技术除评估检测血浆标本外，还分别收集了同源全血、同源血清和部分同源末梢血检测。本研究结果表明，微流控技术检测血浆、同源全血、同源血清和同源末梢血结果与罗氏电化学发光法检测结果间的一元直线回归方程相关性好，离群值在合理范围内。以罗氏电化学发光法为金标准，计算微流控方法在0.5 ng/mL和2.0 ng/mL的医学决定水平的符合率较高，Kappa一致性评判结果较好。因此，该微流控技术与罗氏电化学发光法一致性较好，符合临床检测需求。

本研究结果发现，微流控技术检测血浆PCT与罗氏电化学发光法检测结果具有较高的相关性，即在缩短了检验报告等待时间的同时，也满足了临床高精密度的要求。另外，血浆、全血、血清、末梢血等标本类型在应用于微流控技术检测方法中的一致性较高，大大降低了临床采集标本的要求；针对难以采集静脉血的患者，微流控技术的末梢血模式可减轻该类患者的痛苦，减少报告时间，有利于临床对感染性疾病的快速诊断，从而有效防止脓毒症的发生、发展。PCT水平在临床治疗方面具有一定的指导作用。目前，国际上已基本确立了PCT指导抗菌药物治疗的具体流程[11]，当0.5 ng/mL

此外，微流控技术的应用有利于实现PCT的动态检测，进一步指导临床抗菌药物的应用。脓毒症与脓毒性休克处理国际指南中建议动态监测PCT水平，这有助于缩短脓毒症患者抗菌药物的使用疗程，且对于初始怀疑脓毒症、之后感染证据却不足的患者，PCT水平可作为终止经验性抗菌药物使用的证据[12]。由此发现，PCT作为血清标志物，在指导脓毒症的抗菌药物治疗方面有着重要作用。另外，动态监测血浆PCT水平的变化可准确反映感染的存在[13]，并使抗菌药物疗程明显缩短，有利于改善病情和预后，避免抗菌药物滥用，减少抗菌药物耐药及相关不良反应发生。动态监测PCT水平可通过评估病情，减少住院时间，降低医疗费用，从而减轻患者的经济负担。因此，微流控技术的末梢血检测技术减少了患者静脉采血频次，减轻了患者动态监测PCT水平时的采血痛苦，为临床动态监测PCT水平提供了可操作性及便捷性。

综上所述，微流控技术不仅在早期快速诊断脓毒血症方面具有明显的效益，在临床应用抗菌药物治疗方面的动态监测上也具有更高的可操作性及便捷性。总的来说，微流控技术是一种快速、准确、标本类型多样化的即时检测方法，可大大降低PCT急诊检验的报告时间，减少患者静脉采血的痛苦。然而，本研究也有一定的局限性，在分析微流控技术的灵敏度和特异度时，是以罗氏电化学发光法为金标准，未以患者是否为血流感染为金标准，具有一定的局限性；另外，本次标本量偏少，亟需扩大标本量的前瞻性研究进行验证。