2株临床分离烟曲霉菌株病原学检测及分子鉴定方法比较与分析*

杜伟勤，王淑峰，薛 婷

1.吕梁市人民医院医学检验科，山西吕梁 033000；2.山西医科大学第一医院医学检验科，山西太原 030001；3.山西医科大学第一医院呼吸与危重症医学科，山西太原 030001

烟曲霉是曲霉菌属中最常见一类机会致病性真菌，呈世界性分布，通过空气传播，可在免疫力低下患者中引起危及生命的侵袭性肺曲霉菌病(IPA)。唑类抗真菌药物是临床预防和治疗IPA的首选药物。近年研究发现，烟曲霉对唑类药物的耐药性日益严峻，且耐唑类药物烟曲霉引起的IPA病死率高达100%[1]。然而，临床上由于缺乏早期、快速、敏感和有效的烟曲霉检测方法，IPA患者通常无法及时诊断，进而导致治疗延误。因此，本研究对临床分离的烟曲霉菌株进行病原学检测和分子生物学鉴定，并比较了不同检测方法之间的差异，期望能够辅助临床提升诊断效率，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集山西医科大学第一医院临床疑似肺曲霉菌感染患者痰液标本，经痰涂片、革兰染色镜检，形态学初步鉴定为曲霉菌。

1.2主要试剂 亚甲蓝染液 (珠海贝索生物技术有限公司)，六次甲基四胺、四硼酸钠(辽宁永强医药器械化玻有限公司)，氯化金溶液(Sangon Biotech公司)，甜菜碱(Sigma公司)，Bst DNA聚合酶 (New England BioLabs)，100×羟基萘酚蓝(HNB)溶液(北京百奥莱博科技有限公司)，E.coli DH5α感受态细胞，pMDTM18-T Vector Cloning试剂盒、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DNA Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒(Tiangen公司)。

1.3方法

1.3.1涂片制备及培养 无菌棉签挑取脓性痰液60～100 μL于干燥洁净载玻片右侧2/3处，均匀涂抹10 mm×20 mm左右卵圆形痰膜，自然干燥；迅速通过酒精灯外焰 3～4 次，加热固定待用。接种环挑取脓性痰液2环，直接压片法制备痰液涂片，待镜检。将适量痰液加入10 mL无菌生理盐水的离心管中，剧烈振荡15 s，3 500 r/min离心15 min，弃上清；重复上述步骤，接种环取沉淀分别接种于Sabouraud培养基和真菌显色培养基，置于28 ℃培养箱中，每天观察菌落生长情况。

1.3.2亚甲蓝染色 亚甲蓝溶液染色1 min，双蒸水漂洗，自然干燥后，镜检。

1.3.3改良GMS染色 (1)冰甲醇固定；(2)过碘酸染色5 min，双蒸水洗3 次，甩干；(3)载玻片置于加热板上，GMS工作液覆盖菌膜，加热3～5 min (此过程中避免GMS工作液干涸)，直至涂片颜色变为深褐色，冷却后双蒸水洗3次，甩干；(4)滴加氯化金溶液，作用约15 s，菌膜颜色由深褐色变为灰白色，双蒸水洗3次，甩干；(5)硫代硫酸钠固定3 min，双蒸水洗3次，晾干，镜检。

1.3.4提取烟曲霉DNA 分别取痰液2 mL，加入4倍体积生理盐水洗涤，3 500 r/min 离心10 min，重复上述步骤3次，加入2 mL真菌细胞壁裂解液[100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，1.0% 十二烷基硫酸钠(SDS)，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl]中，剧烈振荡15 s，静置5 min，加10 mg/mL蛋白酶K 10 μL，56 ℃ 6 h，酚-氯仿法提取DNA。

1.3.5PCR扩增 以1.3.4中提取的DNA为模板，所用引物见表1，分别进行PCR扩增，反应体系为25 μL(Premix Taq酶12.5 μL，10.0 mmol/L引物各1 μL，双蒸水8.5 μL)，扩增条件为95 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环，72 ℃延伸8 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物并回收。阳性对照为本实验室保存的烟曲霉菌株，阴性对照为无菌双蒸水。

表1 PCR扩增引物[2-4]

1.3.6TA克隆 采用Nanodrop分光光度计检测胶回收DNA的浓度。10 μL反应体系：pMD18-T Vector 1 μL，DNA (10 ng) 1 μL，RNase-free Water 3 μL，Solusion 5 μL。然后于16 ℃放置过夜，第2天将其加入E.coli DH5α感受态细胞中，轻弹试管底部混匀，置于冰上静置30 min；42 ℃水浴60 s，冰浴1～2 min后，加入890 μL LB 液体培养基中，37 ℃、225 r/min恒温振荡培养60 min；混匀后取100 μL，涂布于含1 μg/mL氨苄西林的LB固体培养基上，待菌液吸收完全，37 ℃恒温培养箱过夜培养。菌落PCR鉴定所用引物为通用引物，扩增体系和条件同1.3.5。琼脂糖凝胶回收后双向测序。

1.4环介导等温扩增(LAMP)扩增 以1.3.5中提取的DNA为模板进行LAMP扩增，所用引物见表2。25 μL反应体系如下：5 μmol/L F3/B3各1 μL，40 μmol/L FIP/BIP各1 μL，10 mmol/L dNTPs 3.5 μL，Betaine 2 μL，100 mmol/L Mg2+1 μL，Bst DNA 聚合酶1 μL，10×Thermo Pol Buffer 2.5 μL，DNA模板 2 μL，加Nuclease-free Water至25 μL。扩增条件为63 ℃ 1 h，扩增产物分别通过观察白色沉淀，琼脂糖凝胶电泳，可视化(在上述反应体系中加入25×HNB 1 μL)及real-time LAMP (在上述反应体系中加入10 μmol/L SYTO-9.0 0.5 μL)进行检测。阳性对照为本实验室保存的烟曲霉菌株，阴性对照为无菌双蒸水。

表2 LAMP扩增所用引物[2]

2 结 果

2.1病原学检测结果

2.1.1培养特性 2株烟曲霉在真菌显色培养基培养，开始为白色菌落；培养3 d后，菌落边缘呈白色，中心为蓝绿色；培养8 d后，菌落呈深绿色。

2.1.2直接压片法结果 痰涂片直接压片结果可见典型呈45°分枝的鹿角样曲霉菌菌丝。

2.1.3亚甲蓝染色 痰涂片亚甲蓝染色结果见图1，可见烟曲霉子囊孢子和典型呈45°分枝的鹿角样菌丝。

注：A为烟曲霉子囊孢子(×400)；B为鹿角样菌丝(×400) 。

2.1.4改良GMS染色 改良GMS染色结果见图2，可见烟曲霉培养物子囊孢子(图2A)，痰涂片可见典型呈45°分枝的鹿角样菌丝(图2B)；图2C和图2D分别显示烟曲霉培养物在油镜和40倍镜下的烟曲霉顶囊，呈烧瓶状，可见分生孢子梗，偶见分枝。

注：A为烟曲霉子囊孢子(×400)；B为鹿角样菌丝(×100)；C为烟曲霉顶囊(×1 000)；D为烟曲霉顶囊(×400)。

2.2分子鉴定结果

2.2.1TA克隆测序结果 本研究中分离的2株烟曲霉不同基因扩增测序结果分别与Genbank已公布序列经Blast分析结果显示，rodA基因的同源性为100.00%；anxc4的基因测序结果显示第30位存在T/C突变，其与Genbank已公布的烟曲霉anxc4同源性大于99.75%(其中C3与KU575847等同源性为100.00%，C4与KU575763的同源性为100.00%)。β-tub基因测序结果与Genbank已公布的烟曲霉β-tub基因同源性为100.00%(Genebank No.KU714964)；ITS基因测序结果与Genbank已公布的烟曲霉ITS基因同源性为100.00%(Genebank No.MT297633)；cyp51B基因测序结果与Genbank已公布的烟曲霉cyp51B基因同源性为100.00%(如MF070895)；cyp51A基因测序结果与Genbank已公布的烟曲霉cyp51A基因同源性为100.00%(如MT468488)。见表3。

表3 2两株烟曲霉不同基因同源性分析结果

2.2.2LAMP检测结果 LAMP扩增后，离心，可见阴性对照无白色沉淀，阳性对照与本研究所收集的标本可观察到白色沉淀；LAMP反应体系中加入HNB溶液，恒温扩增后，可视化检测结果阴性对照为紫色，阳性对照与阳性标本为蓝色；上述扩增产物于2%琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳，阳性对照与阳性标本为LAMP扩增典型梯度条带，阴性对照无条带；real-time LAMP扩增结果显示，阴性对照无扩增，为一水平直线，阳性对照和阳性标本出现“S”型荧光扩增曲线，见图3。白色沉淀、HNB可视化检测结果、琼脂糖凝胶电泳结果与real-time LAMP荧光扩增曲线结果一致，提示LAMP能准确快速鉴定疑似IPA患者呼吸道分泌物中烟曲霉基因。

注：A为白色沉淀；B为琼脂糖凝胶电泳结果；C为real-time LAMP 检测结果；M为DL 2 000 DNA Marker，1为阴性对照，2为阳性对照，3、4为阳性标本。

3 讨 论

烟曲霉广泛存在于自然界，是IPA最常见的一类机会性致病真菌[3-4]。近年来，随着烟曲霉易感人群诸如恶性肿瘤、器官移植受者等免疫机能低下患者的增加，IPA发病率呈逐年上升趋势，其病死率在50%以上[5-6]。快速、准确鉴定烟曲霉，对于严重感染者及时诊断、防治及改善预后至关重要。本研究对本院2例疑似IPA患者的痰液分别进行普通真菌培养、真菌显色培养、直接压片镜检、亚甲蓝染色镜检、改良GMS染色镜检等病原学检测，同时提取其DNA，应用rodA、anxc4、β-tub、ITS、cyp51A和cyp51B基因进行PCR、LAMP、TA克隆、分子鉴定，确定致病菌株为烟曲霉。尽管传统的病原学培养方法检测烟曲霉感染的金标准，但其耗时长，灵敏度低；真菌显色培养菌落颜色虽出现白色-蓝绿色-深绿色的转变，但需要3～8 d随时观察菌落生长状况，且不易与其他曲霉菌菌落形态显色区分；直接压片镜检、亚甲蓝染色镜检虽可见烟曲霉子囊孢子和鹿角样菌丝，但较难与其他曲霉菌形态区分，且镜检时菌丝易与黏液混淆；GMS染色法是检测真菌感染常用的一种染色方法，本研究对传统GMS染色方法进行了改良，缩短了染色时间，镜检可见烟曲霉特征性的顶囊结构，此方法也存在一定局限性，要求检验技术人员具备真菌形态学辨别与鉴定的丰富经验。此外，真菌是实验室常见的污染物之一，病原学检测的特异性并不理想。

rodA、anxc4、β-tub和ITS基因都是曲霉菌分子鉴定中研究的热门靶基因，cyp51A和cyp51B基因与烟曲霉对唑类药物的耐药性相关，也是常用于烟曲霉分子鉴定中的靶基因。本研究分别对临床分离的2株烟曲霉的上述基因进行PCR扩增、TA克隆、鉴定、测序，序列分析结果显示，其与Genbank已公布烟曲霉上述基因的同源性均大于99.7%，确定为烟曲霉菌株。PCR分子鉴定方法较传统病原学方法更快速，且更灵敏，随着PCR条件和核酸测定技术不断成熟，其可能成为临床实验室检测并鉴定丝状真菌的一种技术。然而，PCR分子鉴定方法步骤较多，对临床实验室检验人员以及核酸的质量、纯度、浓度要求较高，且在临床标本的评估中存在较大局限性，阻碍了基于PCR技术在临床实验室应用的推广和发展。尽管针对PCR扩增产物直接测序更加迅速，但为避免直接测序结果中存在某些突变位点是否由于PCR扩增本身所引起。本研究通过TA克隆后再进行测序，保证了测序结果的可靠性。此外，基因突变的原因复杂，遗传因素、机体自身或是PCR扩增过程均可导致碱基的缺失、置换和插入等，且随着Genbank数据库中相似核苷酸序列的逐年更新，序列同源性比对的解读、分析与鉴定更为困难。因此，以病原形态学检测方法为基础，进一步应用PCR的分子鉴定技术确定烟曲霉较可靠。

LAMP是2000年NOTOMI等[7]设计并建立的一种恒温、快速、灵敏的分子生物学核酸扩增诊断技术，随着该技术的不断发展与完善，其广泛应用于临床传染性和非传染性疾病的分子诊断，预计其可替代PCR技术，并且对于将来实现全民健康覆盖(UHC)具有十分重要的价值[8]。本研究以烟曲霉anxc4为目的基因，且选择使用经验证特异性强、检测灵敏度高的LAMP扩增引物，通过将LAMP扩增技术与传统烟曲霉病原学检测方法和PCR技术进行比较，结果显示其可在63 ℃ 1 h 内进行扩增，并同时对扩增产物进行检测，表明其可快速、有效鉴别烟曲霉菌株。LAMP技术简单、高效、快捷，其扩增效率高于PCR，能满足低拷贝数标本的检测[2,8]，且该方法对操作技术、仪器设备、标本处理的要求较低。其他实验室检测诸如血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中半乳糖甘露聚糖(GM)和1,3-β-D-葡聚糖检测(G)的检测，虽然对于IPA患者的诊断具有重要的临床意义[9-11]，但仅有约50%的检测结果与病原学检测结果相匹配[12]，且特异性较差。此外，欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组(EORTC/MSG)对IPA诊断标准仍依赖于组织病理学和传统病原学培养方法，然而在临床实践中，疑似IPA患者体质较弱，往往不耐受侵入性操作，不利于IPA患者的早期诊断。因此，LAMP技术适用于早期烟曲霉感染者的临床实验室鉴定。

综上所述，传统病原学鉴定烟曲霉的方法存在耗时长、灵敏度低等局限性，PCR和LAMP分子诊断技术较传统方法反应迅速且灵敏度高，LAMP技术较PCR操作简单。因此，LAMP技术更适用于临床实验室对IPA患者呼吸道分泌物中烟曲霉的早期鉴定，可辅助提升临床IPA的诊断效率，为临床治疗提供依据。此外，进一步阐明烟曲霉结构、功能、耐药性及耐药机制对抗真菌药物的设计与开发具有重要意义。