广藿香醇在体外对人肝微粒体中CYP3A4的非竞争性抑制作用研究

武梦琳，秦崇臻，柴玉娜，卢瑶瑶，汪新茹，张晶敏，齐光照（郑州大学第一附属医院药学部，郑州450052）

细胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）是最重要的药物代谢酶，在外源性药物的解毒和内源性分子的生物合成中发挥着重要作用[1-2]。CYP3A4在药物代谢酶中占举足轻重的地位，超过60%的临床药物通过此酶代谢，并且其与许多药物间的相互作用有关，因此药物对于CYP3A4的抑制作用会导致药物合用时出现毒副作用[3-4]。

已有许多关于中药对CYPs抑制作用的研究，如三白草酮对CYP2C19的非竞争性抑制作用[5]，芹菜素对CYP2C9的抑制作用[6]，丹参提取物对CYP450的抑制作用[7-8]等。

广藿香是我国传统的中药材，主要用于防治瘟疫、流行性感冒、腹痛等疾病，以广藿香为主要成分的中成药制剂也日益增多[9]。作为广藿香挥发油的主要成分之一，广藿香醇（patchouli alcohol，PA），又称百秋李醇，是天然植物中提取的三环倍半萜化合物[10]，具有抗病毒、神经保护、抗炎、抗真菌以及胃肠调节等活性[11-13]。目前在临床上，广藿香醇也是多种中成药的重要组分，如藿香正气颗粒、小儿感冒颗粒以及小儿广朴止泻口服液等。其中广藿香醇作为小儿感冒颗粒的有效成分之一，可以发汗解表，用于治疗小儿外感风热[14]；作为小儿广朴止泻口服液的主要成分之一，可以化湿健胃，对腹痛、腹泻以及腹胀的治疗有着较好的临床效果[15]。在国家食品安全中，广藿香醇因气味宜人，也常作为食品添加剂和香精香料[16]。因此，应当特别注意广藿香醇与其他药物联用时可能引起的药物相互作用。

目前关于广藿香醇的研究侧重于含量测定、化学结构鉴定以及基础药理学方面[10，17-18]，而在药物相互作用机制中的影响，以及药物联用时对CYPs是否有影响尚未有相关报道。为评估广藿香醇的用药安全，本文通过Cocktail法以探针底物为检测体系，探讨广藿香醇在人肝微粒体和重组酶中的作用以及酶促动力学的影响，旨在为临床提供安全合理的联合用药依据。

1 材料

1.1 仪器

美国Waters公司MS/MS系统：API型三重四级杆质谱仪，带电喷雾离子化源（ESI）及数据采集Masslynx软件；Waters 2695型超高效液相色谱仪带自动进样器和柱温箱；Luna C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）色谱柱。

1.2 试药

香豆素（批号：01260595）、7-羟基香豆素（批号：54826）、甲苯磺丁脲（批号：T0891）、4-羟基甲苯磺丁脲（批号：UC160）、（S）-美芬妥英（批号：UC175）、4'-羟基美芬妥英（批号：H146）、美托洛尔（批号：80337）、α-羟基美托洛尔（批号：80073）、咪达唑仑（批号：M-908）、1-羟基咪达唑仑（批号：H-922）、曲马多（批号：1672600）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）、辅酶Ⅱ（β-NADP）（Sigma公司）。广藿香醇（天津万象恒远科技有限公司，批号：WXHY-001994，HPLC测纯度＞98%）。甲醇、甲酸、乙腈、叔丁基甲基醚和甲酸铵（广州迪马公司，色谱纯）；实验用水为娃哈哈纯净水；其余试剂为分析纯。人肝微粒体和人重组酶（BD基因公司）。

2 方法

2.1 微粒体孵育条件

100 mmol·L－1K2HPO4-KH2PO4（pH＝7.4）的缓冲溶液反应体系（总体积为200 μL）中加入肝微粒体（终质量浓度为0.5 mg·mL－1）或重组酶（终质量浓度为0.5 mg·mL－1）、3.3 mmol·L－1的MgCl2、1.3 mmol·L－1的β-NADP、3.3 mmol·L－1的G-6-P和对应的药物，37℃摇动水浴中预孵化5 min，加入0.4 U·mL－1的G-6-PDH（20 μL），37℃水浴20 min之后用含1.13 μmol·L－1曲马多（内标）的100 μL甲醇终止反应。加入1 mL叔丁基甲基醚，震荡5 min，3500×g离心10 min。分离出800 μL有机层用氮气吹干，100 μL流动相溶解之后进样10 μL到质谱系统。

2.2 色谱、质谱条件

采用课题组以前建立并验证的方法[19]。流动相为10 mmol·L－1乙酸铵（含0.1%甲酸）-乙腈（13∶87，V/V），流速为0.25 mL·min－1，总时间为5 min。离子源温度和去溶剂温度分别为100℃和400℃。锥孔气和脱溶剂气分别设定为50 L·h－1和400 L·h－1。ESI源，MRM扫 描，正离子模式监测。

2.3 广藿香醇对肝微粒体酶抑制动力学实验

2.3.1 广藿香醇对CYP450的抑制作用 加入浓度分别为0、0.1、1和10 μmol·L－1广藿香醇，孵育体系下测定每个CYP450对应的特异性底物的代谢物浓度。每个样品平行做3份。

加入浓度分别为0.01、0.1、1、10和100 μmol·L－1广藿香醇，孵育体系下测定CYP3A4酶活性，将所得数据以抑制剂浓度的log值（μmol·L－1）作为横坐标，剩余活性率（%）作为纵坐标作图。采用Graphpad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）软件计算广藿香醇的IC50。

2.3.2 广藿香醇在人肝微粒体中对CYP3A4的抑制模型 为了验证广藿香醇的抑制类型，将广藿香醇（0、5、10 μmol·L－1）在加入NADPH的人肝微粒体中预孵育0、10或30 min，然后加入CYP3A4特异性底物咪达唑仑（5、10或20 μmol·L－1），37℃孵育30 min。每个样品平行做3份。所得数据采用SigmaPlot软件（版本10.0，Systat software，Inc.：Chicago，IL，USA） 做Lineweaver-Burk图和二次作图。

2.3.3 CYP3A4重组酶验证实验 为验证广藿香醇选择性抑制CYP3A4，将广藿香醇（0.01、0.1、1、10和100 μmol·L－1）、咪达唑仑和NADPH系统在10 pmol人重组CYP3A4酶中37℃孵育30 min。每个样品平行做3份。所得数据以抑制剂浓度的log值（μmol·L－1）作为横坐标，剩余活性率（%）作为纵坐标作图，采用Graphpad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）软件计算广藿香醇的IC50。

2.4 统计分析

计算人肝微粒体中不同浓度广藿香醇对酶活性的影响，每个样品平行3份，数据表示为平均值±SD，采用方差分析，P＜0.05示差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）通过非线性回归计算50%抑制浓度（IC50）值。Lineweaver-Burk图采用SigmaPlot软件（版本10.0，Systat software，Inc.：Chicago，IL，USA）制作。

3 结果

3.1 广藿香醇对人肝微粒体中CYP450酶的抑制作用

加入不同浓度广藿香醇（0、0.1、1和10 μmol·L－1）后对酶底物代谢产物进行测定，分析剩余活性，结果见图1A。由图可知广藿香醇对人肝微粒体CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6并无明显的抑制作用，且与浓度无关。而在图1B中，随着广藿香醇浓度升高，肝微粒体CYP3A4 活性明显下降，其IC50值为5.195 μmol·L－1。提示当药物经由CYP3A4代谢时，广藿香醇可能对其会有抑制作用。

图1 人肝微粒体中不同浓度广藿香醇对CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6酶（A）和CYP3A4酶（B）活性的影响Fig 1 Effect of different concentrations of PA on the enzyme activities of CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19 and CYP2D6（A），and CYP3A4（B）in human liver microsomes

3.2 广藿香醇对CYP3A4的抑制特点

从图2可以看出，不同浓度的广藿香醇对CYP3A4抑制作用不同，随着广藿香醇浓度的增加，CYP3A4活性降低；而不同时间段的广藿香醇对CYP3A4抑制作用没有明显的差异。因此广藿香醇呈现浓度依赖性地抑制肝微粒体中CYP3A4催化的咪达唑仑羟基化，但不具有时间依赖性。

图2 广藿香醇对CYP3A4酶的抑制特点Fig 2 Inhibition characteristics of PA on CYP3A4 enzyme

3.3 广藿香醇对CYP3A4的抑制作用类型分析

以底物浓度1/[S]作为横坐标，反应速度1/[V]作为纵坐标，按 Lineweaver-Burk 法作图，确定提取物的抑制类型，结果见图3A。以广藿香醇浓度作为横坐标，Lineweaver-Burk图中几条直线的斜率作为纵坐标，作图得图3B，据此可以得到广藿香醇抑制常数（Ki）。

从图3A中可以看出，不同浓度广藿香醇共同孵育之后所得的曲线有一个共同交点并且落在横坐标轴上，说明广藿香醇对于CYP3A4抑制类型为非竞争性抑制。从图3B中可以计算得到广藿香醇抑制常数Ki为0.86 μmol·L－1。

图3 广藿香醇对CYP3A4酶代谢的动力学直线回归方程Fig 3 Kinetic linear regression equation of PA for CYP3A4 enzyme metabolism

3.4 广藿香醇对CYP3A4重组酶的抑制作用

采用10 pmol人重组CYP3A4与广藿香醇共同孵育，验证广藿香醇对于CYP3A4选择性抑制作用，结果见图4，发现广藿香醇可以显著抑制CYP3A4活性，其IC50值为5.625 μmol·L－1，广藿香醇对CYP3A4具有选择性抑制作用，这与在人肝微粒体中实验结果一致。

图4 人重组CYP3A4酶中广藿香醇（0.01、0.1、1、10及100 μmol·L－1）对咪达唑仑代谢的影响Fig 4 Effect of PA（0.01，0.1，1，10 and 100 μmol·L－1） on midazolam metabolism in recombinant human CYP3A4 enzyme

4 讨论

联合用药在患者治疗过程中非常普遍，但是联合用药过程中存在药物相互作用的可能性。药物相互作用一般由CYPs酶代谢引起，从而导致严重的不良反应[20-21]。目前，有关药物相互作用的报道越来越多，因此研究药物对CYPs的抑制作用可以预测可能发生的药物相互作用，从而避免或减少联合用药时的严重不良反应发生。广藿香醇具有抗炎、抗氧化、抑菌、抑制病毒、抗克氏锥虫、免疫调节、抗肿瘤等药理活性[9-13，17]。其在临床使用的过程中，可能会与经 CYP3A4代谢消除的药物联合使用，从而影响药物的有效性和安全性。常见含广藿香醇的药物如藿香正气水，应当特别注意与其他药物联用时可能引起的药物相互作用。本研究利用经典的肝微粒体体外孵育模型，探讨广藿香醇对CYP3A4的影响及作用机制。

本研究首次检测了广藿香醇对CYPs 的抑制作用、抑制类型以及机制模型，发现广藿香醇对CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6活性没有明显的抑制作用，对CYP3A4活性的抑制作用呈浓度依赖性，但不具有时间依赖性。在广藿香醇对CYP3A4的抑制作用类型分析中，得到了Ki值为0.86 μmol·L－1，可以判断药物抑制作用的类型主要是非竞争性抑制。随后采用体外人肝微粒体孵育和重组酶验证作为主要的实验方法，通过CYP3A4重组酶验证了这一结果。因此，当联用药物经由CYP3A4代谢时，可能会由于广藿香醇的抑制作用，该药不能被及时代谢，而导致药物的血药浓度升高，造成蓄积中毒等情况。这为预测药物和药物之间的相互作用以及临床上应用含广藿香醇成分的药物的安全性提供了参考，但其在临床使用中的真实情况，尚需动物体内实验以及临床试验的验证。