2-三氟甲基-3-硝基-喹啉-4-胺衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究

2021-11-01张偲偲余佳曾晓萍梁光义孟雪玲徐必学贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室贵阳550014贵州医科大学药学院贵阳550025贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室贵阳550014

中南药学 2021年10期

张偲偲，余佳，曾晓萍，梁光义，孟雪玲，徐必学*（1. 贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵阳 550014；2. 贵州医科大学药学院，贵阳 550025；3. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵阳 550014）

喹啉及其衍生物是一类非常重要的氮杂环化合物[1]，具有多方面的生物活性，如抗疟疾[2-3]、抗菌[4-6]、抗炎症[7]、抗惊厥、降压、抗糖尿病、抗肿瘤[8-9]等，在制药工业中应用广泛。马来酸来那替尼和马来酸吡咯替尼都是喹啉类酪氨酸激酶抑制剂，它们均是通过阻止表皮生长因子受体的信号通路转导，来达到抗肿瘤的目的[10]。有研究表明喹啉作为抗肿瘤药物时，其母核3位氰基可以与水分子结合，该水分子可以充当药物和酶之间连接的桥梁从而发挥药效，Li等[11]采用硝基替代氰基，也获得具有良好抗肿瘤活性的化合物，且硝基在抗肿瘤药物中应用广泛[12]。醛氧化酶（aldehyde oxidase，AOX）是存在于哺乳动物细胞质中的一类含钼-黄素蛋白，具有广泛的底物特异性，可催化醛类及含氧、含氮杂环类化合物的氧化反应[13-16]。由于AOX的氧化作用，在体内代谢过程中，2-位无取代喹啉类药物易被氧化成2-喹啉酮类化合物，此类化合物易结晶沉淀而引起肾脏毒性[17-18]。

由于氟原子具有最强的电负性（4.0）和很强的C-F键等特殊性，使得含氟化合物在许多领域，特别是在医药领域得到了广泛应用[19]，通过引入三氟甲基（-CF3）取代基能显著改变原化合物的化学稳定性、亲脂亲油性、生物膜通透性、体内代谢稳定性及其与生物蛋白酶结合的能力等[20]。如为改善奎宁2-位易被氧化失活的问题，研究人员在2-位引入CF3，从而发现了代谢阻滞剂甲氟喹，其不良反应大大减小，活性更强（见图1）。

图1 来那替尼、吡咯替尼、奎宁、甲氟喹和拟合成的目标化合物结构式Fig 1 Structural formula of neratinib，pyrotinib，quinine，mefloquine and target compounds

结合三氟甲基取代的优点和喹啉母核作为抗肿瘤药物这一优势结构，本文设计合成了一系列2-三氟甲基-3-硝基-喹啉-4-胺衍生物（见图2），并以阿霉素为阳性对照，采用MTT法[21]测试目标化合物对乳腺癌细胞（MDA-231）、前列腺癌细胞（LNCAP）、人肺癌细胞（A549）、前列腺癌细胞（PC3）的体外抑制活性。

1 仪器与试药

GB3002型电子天平（METTLER TOLEDO）；MYP19-2型磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Rotavaper R-114型旋转蒸发仪（BUCHI）；XT-4型熔点仪（上海华岩仪器设备有限公司）；Bruker Avance NEO 600 MHz型核磁共振仪（DMSO-d6或CDCl3为溶剂，TMS为内标，瑞士Bruker公司）；HP-5793型质谱仪（Hewlett-Packard公司）；恒温培养箱（美国Grant公司）；超低温冰箱（美国Beckman公司）；显微镜（Olympus Corporation）；多功能酶标仪（美国Biotek公司）。柱层析硅胶（200～300目）和薄层层析硅胶板（青岛海洋化工厂）；四氮唑蓝（MTT，Sigma公司）；所用试剂均为市售分析纯或化学纯；A549细胞（湖南丰晖生物科技有限公司）；PC3细胞、LNcap细胞、MDA-231细胞（贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室）。

2 方法与结果

2.1 目标化合物合成路线

将4-甲氧基苯胺和三氟乙酰乙酸乙酯以多聚磷酸催化反应得化合物1，1经硝化反应得化合物2，2进行氯代反应得化合物3，3与苯胺类化合物进行偶联得喹啉类衍生物4a～4f，4a～4d经N-烷基化反应得化合物5a～5d'（见图2）。

图2 目标化合物的合成路线图Fig 2 Synthesis route of target compounds

2.2 化学合成

2.2.1 2-三氟甲基-4-羟基-6-甲氧基-喹啉（化合物1）的合成取多聚磷酸22.00 g（65.10 mmol）、4-甲氧基苯胺2.00 g（16.20 mmol）于250 mL反应瓶内，置换氩气，于100℃下搅拌0.5 h后缓慢注入三氟乙酰乙酸乙酯2.40 mL（16.40 mmol），注入完毕升温至110℃。反应4 h至完毕，将反应物分散至冰水混合物中并且迅速搅拌，大量固体析出，抽滤，滤饼水洗至中性，减压烘干即得化合物1，收率：77.9%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ7.91（d，J＝8.4 Hz，1H），7.52～7.35（m，2H），7.10（s，1H），3.89（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ162.1，158.4，145.4，144.4，131.1，123.3，122.7，125.1～119.1（m），100.5，100.3，56.0；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－66.12。

2.2.2 2-三氟甲基-3-硝基-6-甲氧基-4-氯-喹啉（化合物3）的合成取化合物1 2.00 g（8.22 mmol）于反应瓶内，加入冰醋酸50 mL，置换氩气，40℃下缓慢滴加浓硝酸0.70 mL（9.86 mmol）。40℃下搅拌11 h至反应完全，反应体系内析出大量沉淀，抽滤，水洗滤饼至中性，减压烘干即得化合物2共1.61 g，取化合物2的粗品1.61 g，加入20 mL DMF将其完全溶解，置换氩气，于100℃下，缓慢注入三氯氧磷1.53 mL（16.76 mmol）。搅拌2 h后反应完毕，将反应体系分散于乙酸乙酯和水中，萃取，有机层用水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，减压回收溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化，得化合物3（共1.21 g），收率：75.2%。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ8.23（d，J＝9.2 Hz，1H），7.78（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.54（s，1H），4.05（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ162.4，142.1，140.7，133.2（q，J＝34.2 Hz），133.9，132.7，128.4，127.6，120.4（q，J＝275.6 Hz），103.3，56.9；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.62。

2.2.3 化合物4的合成（以4a为例）取化合物3 200 mg（652 μmol），注入冰醋酸3 mL，置换氩气，加入4-氟苯胺310 μL（326 μmol），100℃下搅拌24 h至反应完全，将反应物分散于乙酸乙酯和水中，萃取，有机层用水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，减压回收溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化，得黄色固体状化合物4a，收率为73.5%。参照上述方法合成4b～4f。

2-三氟甲基-N-（4-氟苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4a）：黄色固体，m.p.129～132℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.04（d，J＝9.2 Hz，1H），7.97（s，1H），7.41（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.10～6.95（m，4H），6.87（d，J＝2.6 Hz，1H），3.50（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ160.8，159.1，159.0，142.8，141.4，137.9（q，J＝35.8 Hz），137.3（d，J＝3.0 Hz），133.2，132.7，125.2，123.7（d，J＝7.8 Hz），122.3，120.4（q，J＝275.5 Hz），116.6，116.4，104.5，55.3；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－63.81，－116.21；MS（ESI）m/z：382.0 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-（3，4-二氯苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4b）：收率为65.0%。黄色固体，m.p. 188～193℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.70（s，1H），8.10（d，J＝9.2 Hz，1H），7.72（d，J＝2.5 Hz，1H），7.65（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.55（d，J＝8.7 Hz，1H），7.36（d，J＝2.6 Hz，1H），7.07（dd，J＝8.7，2.6 Hz，1H），3.92（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ160.3，149.6，141.9，140.8，136.4（q，J＝34.8 Hz），132.4，131.8，131.2，126.2，125.4，122.6，121.32（q，J＝275.5 Hz），121.2，114.9，114.5，103.4，56.6；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.1；MS（ESI）m/z：432.1 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-（苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4c）：收率为78.0%。黄色固体，m.p.135～142℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.61（s，1H），8.03（d，J＝9.2 Hz，1H），7.81（d，J＝2.6 Hz，1H），7.59（dd，J＝9.2，2.7 Hz，1H），7.32（dd，J＝8.2，7.6 Hz，2H），7.16（t，J＝7.4 Hz，1H），7.10（d，J＝7.6 Hz，2H），3.88（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ159.9，141.6，141.5，139.9，136.6（q，J＝33.9 Hz），132.3，130.2，129.4，125.4，125.0，124.4，122.3，121.37（q，J＝276.0 Hz），103.4，56.5；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.17；MS（ESI）m/z：364.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-（4-三氟甲氧基苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4d）：收率为75.5%。黄色固体，m.p. 115～131℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.69（s，1H），8.07（d，J＝9.2 Hz，1H），7.74（d，J＝2.6 Hz，1H），7.62（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.31（d，J＝8.4 Hz，2H），7.21（dd，J＝9.5，2.6 Hz，2H），3.88（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ160.1，145.1，141.7，141.4，139.6，136.5（q，J＝34.6 Hz），132.4，131.1，125.3，124.6，123.4，122.2，121.57（q，J＝275.7 Hz），120.62（q，J＝275.6 Hz），103.5，56.5；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－57.16，－63.20；MS（ESI）m/z：448.0 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-（4-氯苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4e）：收率为70.0%。黄色固体，m.p. 180～183℃，1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ9.67（s，1H），8.07（d，J＝9.2 Hz，1H），7.79（d，J＝2.6 Hz，1H），7.62（dd，J＝9.2，2.6 Hz，1H），7.44～7.30（m，2H），7.12（d，J＝8.7 Hz，2H），3.91（s，3H）；13C NMR（151 MHz，DMSO-d6）δ160.1，141.6，141.3，139.2，136.5（q，J＝34.5 Hz），132.4，130.7，129.3，128.9，125.2，124.6，121.59（q，J＝275.8 Hz），103.4，56.6；19F NMR（565 MHz，DMSO-d6）δ－63.15；MS（ESI）m/z：400.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-（2，3，4-三氟苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（4f）：收率为60.0%。黄色固体，m.p. 210～214℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.14（d，J＝9.3 Hz，1H），7.53（dd，J＝9.2，2.7 Hz，1H），7.46（s，1H），6.89（d，J＝2.7 Hz，1H），6.53（dd，J＝8.1，5.7 Hz，2H），3.68（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ160.0，152.49（q，J＝103.52 Hz），143.1，138.9，137.6，137.46（q，J＝35.8 Hz），135.5，133.0，125.7，123.3，120.24（q，J＝275.5 Hz），104.5（d，J＝5.7 Hz），104.4（d，J＝5.4 Hz），103.7，55.7；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－63.90，－131.38，－131.42，－164.96；MS（ESI）m/z：440.1 [M＋Na]＋。

2.2.4 化合物5的合成（以5a为例）取化合物4a 300 mg（0.79 mmol）、NaH 39.2 mg（0.98 mmol）于反应瓶中，置换氩气，加入4 mL DMF，搅拌下注入碘甲烷98.0 μL（1.57 mmol），室温反应48 h至反应完全，将反应物分散于乙酸乙酯和水中，萃取，有机层用水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，减压回收溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化，得化合物5a 150 mg，收率为48.4%。参照上述方法合成5b～5d'。

2-三氟甲基-N-甲基-N-（4-氟苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5a）：黄色固体，m.p.117～146℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.19（d，J＝9.3 Hz，1H），7.53（dd，J＝9.3，2.8 Hz，1H），6.98（d，J＝2.7 Hz，1H），6.97～6.91（m，2H），6.69～6.63（m，2H），3.76（s，3H），3.39（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.1，157.5，144.9，144.2，143.2，141.8，136.8（q，J＝36.9 Hz），132.8，129.1，125.7，120.3（q，J＝275.9 Hz），116.4（d，J＝8.1 Hz），116.1（d，J＝22.5 Hz），102.1，55.8，39.7；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－64.39；MS（ESI）m/z：418.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-甲基-N-（3，4-二氯苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5b）：收率为80.0%。黄色固体，m.p. 120～134℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.23（d，J＝9.3 Hz，1H），7.58（dd，J＝9.3，2.7 Hz，1H），7.22（d，J＝8.9 Hz，1H），6.91（d，J＝2.7 Hz，1H），6.78（s，1H），6.39（d，J＝7.4 Hz，1H），3.81（s，3H），3.36（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.6，146.0，144.4，143.2，142.0，136.6（q，J＝36.7 Hz），133.4，133.0，130.9，128.9，126.1，123.6，120.1（q，J＝275.7 Hz），115.4，113.9，101.6，55.9，39.4；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－64.39；MS（ESI）m/z：446.1 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-甲基-N-苯基-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5c）：收率为77.8%。黄色固体，m.p. 126～142℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.19（d，J＝9.3 Hz，1H），7.52（dd，J＝9.3，2.8 Hz，1H），7.23（dd，J＝8.5，7.5 Hz，2H），6.98（d，J＝2.7 Hz，1H），6.92（t，J＝7.4 Hz，1H），6.70（d，J＝8.0 Hz，2H），3.72（s，3H），3.41（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.0，146.8，145.0，144.3，142.0，136.6（d，J＝33.9 Hz），132.7，129.5，129.3，125.8，120.7，121.37（d，J＝276.0 Hz），115.0，102.2，55.8，39.3；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－64.41；MS（ESI）m/z：400.1 [M＋Na]＋。

2-三氟甲基-N-甲基-N-（4-三氟甲氧基苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5d）：收率为39.8%。黄色固体，m.p. 96～110℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.22（d，J＝9.3 Hz，1H），7.56（dd，J＝9.3，2.8 Hz，1H），7.10（d，J＝8.8 Hz，2H），6.95（d，J＝2.7 Hz，1H），6.67～6.58（m，2H），3.75（d，J＝8.2 Hz，3H），3.71～3.65（m，2H），1.77（dt，J＝18.8，7.6 Hz，2H），0.97（t，J＝7.4 Hz，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.1，145.0，144.3，143.7，142.5，142.3，136.7（q，J＝36.9 Hz），132.8，129.6，125.8，122.5，120.92（q，J＝255.5 Hz），120.29（q，J＝276.5 Hz），115.8，102.3，55.7，39.5；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－58.35，－64.45；MS（ESI）m/z：462.1 [M＋H]＋。

2-三氟甲基-N-丙基-N-（4-三氟甲氧基苯基）-3-硝基-6-甲氧基-喹啉-4-胺（5d'）：收率为41.1%。黄色固体，m.p. 107～132℃，1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ8.23（d，J＝9.3 Hz，1H），7.58（dd，J＝9.3，2.7 Hz，1H），7.22（d，J＝8.9 Hz，1H），6.91（d，J＝2.7 Hz，1H），6.78（s，1H），6.39（d，J＝7.4 Hz，1H），3.81（s，3H），3.36（s，3H）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ161.6，146.0，144.4，143.2，142.0，136.6（q，J＝36.7 Hz），133.0，130.9，128.9，126.1，123.6，120.7（q，J＝256.7 Hz），120.1（q，J＝275.7 Hz），115.4，113.9，101.6，56.0，21.2，11.1；19F NMR（565 MHz，CDCl3）δ－58.35，－64.45；MS（ESI）m/z：490.1 [M＋H]＋。

2.3 抗肿瘤活性测试

以阿霉素为阳性对照，采用MTT法测试目标化合物对MDA-231、LNCAP、A549、PC3细胞的体外抑制活性。分别取上述4种处于对数期的癌细胞，接种于96孔板中，培养24 h，取目标化合物及阿霉素用DMSO溶解完全，用无血清的培养基稀释给药，使96孔板每孔化合物终浓度为5 μmol·L－1。继续培养48 h后加入20 μL 5 mg·mL－1MTT溶液继续培养4 h。弃去上清液，加入150 μL DMSO，避光、低速震荡至完全溶解。于490 nm波长下用酶联免疫检测仪测量吸光度（OD）值，重复3次，计算抑制率，结果见表1。

表1 目标化合物的体外抗肿瘤活性Tab 1 Antitumor activities of the target compounds in vitro

由表1可知，在浓度为5 μmol·L－1时，4b、4f、5a、5c 4个化合物对4种肿瘤细胞具有一定的抑制作用，4-位N原子上烷基化后活性有所升高。为进一步阐明构效关系，后期将设计合成更多取代类型的2-三氟甲基-3-硝基-喹啉-4-胺类衍生物。

3 讨论

3.1 合成部分

本文通过以4-甲氧基苯胺为起始原料，通过环化、硝化、氯代、偶联、烷基化等反应，设计合成新型3-硝基-喹啉-4-胺衍生物11个。在化合物2的合成中，为防止喹啉环3-位和5-位同时引入硝基，浓硝酸的当量数应严格控制在1.0～1.2 eq。在本文采用的3-硝基-喹啉-4-胺类化合物合成路线中，部分中间体只需简单的沉淀法或萃取法纯化（不需要进行柱层析纯化）即可直接用于下一步反应，总收率较高。