四物汤防治动脉粥样硬化分子机制的网络药理学研究及实验验证

张盟，孙丽萍，高文雅，赵丕文*（. 北京中医药大学 生命科学学院，北京 0488；. 北京中医药大学 中医学院，北京 0488）

根据世界卫生组织的相关统计，心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）在近几十年内已发展成为导致人类死亡的主要原因之一。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心肌梗死及脑卒中等心血管疾病的根本原因，典型特征是动脉壁上的AS斑块，在冠状动脉网络、脑、外周动脉有不同程度的临床表现，是心血管疾病发生的基础[1]。

四物汤由熟地、当归、白芍、川芎四味中药组成[2]。中医学既往并无AS对应病名记载，依据致病特点及临床表现。AS归属于中医学“脉痹、眩晕、胸痹心痛、中风、头痛”等病症范畴，主要证候为痰瘀互结证、气虚血瘀证等，针对不同证型AS的主要治疗药物中，多数都包括了四物汤中的几味药物[3]。

为了能够更加深入、全面地探讨四物汤防治AS作用的分子机制，本研究首先采用网络药理学结合GEO数据库挖掘，对其可能发挥作用的途径和靶点进行探究；在此基础上，应用血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）进行四物汤防治AS相关分子机制的体外实验验证。

1 方法

1.1 网络药理分析方法

1.1.1 四物汤中主要活性化合物的筛选与对应靶点的收集 采用TCMSP平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以类药性（drug-like property，DL）＞0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%为条件筛选主要活性化合物[4]。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）网站中获取目标化合物SDF结构图，将该结构图导入Swisstarget平台（http：//swisstargetprediction.ch/）[5-6]，对目标化合物相关靶点进行预测，以可能性Probability＞0.2筛选靶点，通过Cytoscape 3.8.0构建“四物汤-单味药-化合物-靶点”的网络[7]。

1.1.2 AS相关靶点的收集 以AS为关键词，在DrugBank（https：//www.drugbank.com/）与OMIM数据库（https：//www.omim.org/）中搜索该疾病相关靶点。在GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索AS疾病相关基因表达数据集；筛选目标数据集所测样本有＞10个样本数量的AS斑块组织，同时具有＞10个样本数量的正常血管组织作为对照。从选定的基因表达数据集中使用GEO2R工具分析，得到各基因的表达水平情况，生成样本的基因火山图；以P-value＜0.05和∣log2（fold change）∣＞1为标准筛选具有统计学意义的差异表达基因（differential expressed genes，DEGs），选取上升和下降最显著的前20个基因绘制热图。

1.1.3 四物汤防治AS的靶点收集 将“1.1.2”项下获得的AS相关基因取合集，与“1.1.1”项下获四物汤主要活性化合物对应靶点同步导入Cytoscape 3.7.0中，取两部分的交集，预测四物汤防治AS的靶点，并构建“化合物-靶点”的网络。

1.1.4 GO与KEGG通路富集分析 将“1.1.3”中预测的四物汤防治AS的靶点导入David数据库，进行基因本体论（GO）富集分析，分析四物汤对细胞生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular component，CC）和分子功能（MF）三个分类的作用[8]；对靶点进行京都基因百科全书（KEGG）富集分析，以P-value＜0.05为标准进行筛选。

1.1.5 PPI网络构建与分析 将得到的四物汤防治AS的靶点输入String数据库（https：//stringdb.org），检索“互作基因/蛋白质”，限定研究物种为智人，进行蛋白-蛋白相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）的构建，以PPI评分阈值＞0.4进行预测[9]。导入Cytoscape 3.8.0软件对PPI结果进行可视化。

1.2 体外实验方法

1.2.1 实验材料 大鼠胸大动脉平滑肌A7R5细胞（上海中科院细胞库）；熟地、当归、白芍、川芎（经北京中医药大学刘启福教授鉴定为正品，北京同仁堂药店）；氧化低密度脂蛋白（广东奕源生物）；DMEM 细胞培养液、胎牛血清、0.25%胰酶、青/链霉素（赛默飞世尔生物化学制品）；一氧化氮试剂盒（北京百瑞极生物）；TRITC荧光标记二抗（中杉金桥）；子α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、ERα抗体（Abcam）；eNOS抗体、GADPH抗体、山羊抗兔二抗（proteintech）。

1.2.2 制备四物汤冻干粉 精密称取熟地30 g，当归18 g，白芍18 g，川芎12 g（共78 g药物），用8倍体积水浸泡30 min，煎煮2次，每次1 h，过滤后合并滤液，将溶液浓缩至约200 mL，12 000 r·min－1离心10 min后取上清液，置于圆底烧瓶装至冻干机，以－80℃冻干过夜。制得中药冻干粉40 g，每1 g冻干粉含有四物汤生药1.95 g。

1.2.3 VSMCs培养 使用含有10%胎牛血清与1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，在37℃，5%CO2，100%湿度的培养箱中培养A7R5细胞。

1.2.4 VSMCs细胞的鉴定 免疫荧光检测平滑肌细胞特异性标记分子α-SMA；将正常生长至70%密度以上的VSMCs细胞用4%多聚甲醛固定30 min，封闭后使用α-SMA抗体进行4℃孵育过夜；第二日，使用荧光标记二抗在室温下避光孵育1 h，激光共聚焦显微镜（Olympus FV3000，Tokyo，Japan）下获取图像。

1.2.5 细胞增殖能力测定 将VSMCs以每孔8×104个细胞的密度接种于96孔板，培养24 h后进行处理；在四物汤对VSMCs增殖能力的影响实验中，设置空白对照组与四物汤组（培养基稀释药物质量浓度分别为0、25、50、75、100、250、500、750、1000、1250、1500 μg·mL－1），空白对照组仅做基础培养。在四物汤对ox-LDL诱导的VSMCs增殖能力影响实验中，设置空白对照组（基础培养基）、模型组、四物汤低剂量组、四物汤中剂量组和四物汤高剂量组；根据文献中所用剂量[10]，模型组与四物汤组加入氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）100 μg·mL－1进行诱导增殖，构建细胞AS模型，四物汤组同时加入100、500、1000 μg·mL－1四物汤，处理24 h后，加入CCK8试剂，37℃孵育2～3 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度值，计算细胞增殖率。

1.2.6 一氧化氮含量测定 VSMCs按每孔3×105个细胞的密度接种至6孔板，培养24 h后进行处理，分组设置与处理同“1.2.5”中细胞增殖实验。37℃ 5% CO2培养箱中孵育48 h后，收集细胞上清液，4℃，3000 r·min－1离心15 min去除上清中漂浮细胞。按一氧化氮（NO）检测试剂盒说明书，制作NO含量标准曲线，根据吸光度值计算细胞上清中NO含量。

1.2.7 Western blot法检测蛋白表达量 根据网络药理分析结果，选择四物汤防治AS的关键靶点进行实验验证。VSMCs按每孔6×105个细胞的密度接种至T25培养瓶，培养24 h后进行处理，分组设置与处理同“1.2.5”项下，给药48 h后，低温下提取细胞总蛋白。蛋白样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳，后将蛋白从凝胶转电转到PVDF膜，封闭后置于一抗中在4℃冰箱孵育过夜，将二抗在室温摇床上孵育1 h，于凝胶成像仪（BIORAD化学发光凝胶成像系统）成像。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行分析处理。计量资料数据用均数±标准差表示，实验数据分析均采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理分析结果

2.1.1 四物汤中主要活性化合物 从TCMSP数据库中检索到四物汤中共含有475个化合物，包括白芍85个、川芎189个、熟地76个、当归125个，排除重复化合物得到438个，根据“1.1.1”项下所述OB与DL值筛选得到20个主要活性化合物（见表1）。

表1 四物汤中药物所含主要活性化合物Tab 1 Main active compounds in SWT

2.1.2 四物汤中主要活性化合物对应靶点 在TCMSP与Swiss target数据库中分别获取20个化合物潜在作用靶点，TCMSP数据库中获得14个化合物对应的192个潜在靶点，Swiss target数据库中获得14个化合物对应的143个潜在靶点，有6个化合物在两个数据库中均未获得预测靶点；所有潜在靶点去掉重复项后取合集，共得到203个潜在作用靶点。主要活性化合物与预测靶点关系网（见图1），其中黄色为中药名称缩写，橙色为主要活性化合物，绿色为预测靶点。

图1 主要活性化合物-靶点网络Fig 1 Major active compounds-target network

2.1.3 AS疾病相关基因 以AS为关键词，在OMIM和Drugbank数据库中进行检索查询，分别得到270个、62个靶点。在GEO数据库中选取GSE100927数据集，其中包括69个AS斑块样本和35个正常动脉组织的基因组信息，以鉴定AS和健康动脉外周动脉之间的DEGs[11]。使用GEO2R工具进行基因表达差异分析，共得到54 674个基因的表达信息，其中表达上调基因27 237个，下调基因27 437个，生成样本的基因火山图见图2：零点右侧（log2FC＞0）为表达水平上调基因，零点左侧（log2FC＜0）为表达水平下调基因，显著上调的基因多于显著下调的基因；红色和绿色分别代表上调基因（log2FC＞1）和下调基因（log2FC＜1），即相比较于正常组织的表达水平，部分基因的表达水平高于或低于正常水平2倍，灰色表示差异不显著。根据P＜0.05和∣log2（fold change）∣＞1标准筛选全部基因表达信息，共得到552个AS组织与正常动脉组织的DEGs。选取正常与AS动脉组织各20组样本，与∣log2（fold change）∣＞1的基因中上调和下调最显著的前20个基因绘制热图（见图3）。将上述DEGs与Drugbank和OMIM数据库中筛选的AS相关基因取合集，去除重复项，得到848个AS相关的基因。

图2 GSE100927数据集中基因分布火山图（P＜0.05）Fig 2 Volcano map of gene distribution in GSE100927 dataset（P＜0.05）

图3 GSE100927数据集中差异表达基因聚类热图Fig 3 Heat map clustering of DEGs in GSE100927 dataset

2.1.4 四物汤防治AS的靶点 将所得四物汤主要活性化合物对应靶点与得到的AS相关基因取交集，得到四物汤防治AS的靶点共37个。山柰酚、儿茶酸、杨梅酮、川芎哚、β-谷甾醇、豆甾醇分别与22个、8个、8个、8个、7个、6个靶点相关。与四物汤主要活性化合物关系最密切的靶点是PTGS1、PTGS2、ALOX5、RXRA、F2和ESR1（见图4）。

图4 预测靶点与对应的主要活性化合物Fig 4 The predicted targets and corresponding main active compounds

2.1.5 GO及KEGG通路富集分析 GO富集分析结果显示，四物汤防治AS的靶点参与影响176个BP，19个CC与33个MF，选择GO分析各部分前10条绘制柱状图（见图5）；其中四物汤对BP影响主要涉及炎症反应、对血压调节、对雌激素反应等方面；对CC影响主要涉及质膜、细胞外空间和细胞外区域等方面；对MF影响主要涉及蛋白质绑定、酶绑定、蛋白质同源二聚化活动、锌离子结合、血红素结合等方面。KEGG富集分析结果显示，四物汤防治AS的靶点共涉及到51条信号通路，将KEGG富集分析的前10条通路绘制成气泡图见图6；P值从大到小在图上显示为气泡颜色从绿色到红色；气泡面积大小与通路涉及的基因数量正相关；横轴表示该条通路涉及基因占总体输入基因的比例。四物汤防治AS的靶点所参与的通路主要集中在肿瘤坏死因子（TNF）、NF-κB、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、乙型肝炎（HBV）等通路。

图5 预测靶点的GO功能富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of the predicted targets

图6 预测靶点的KEGG富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis of the predicted targets

2.1.6 PPI网络构建及分析 PPI网络共有37个节点和186个相互作用的边（见图7），网络中节点（圆形）表示由基因编码的蛋白质，边线表示两个节点间的相互作用。对于每对节点间的关联强度的评价有多维度指标（如基因融合、共表达与大规模实验的支持等），将多个维度指标计算整合形成综合评分，可以提高对节点间关联强度评价的可信度（在PPI网路图中，边线约宽，节点间关联强度约高）[12]。从图7中可以得出，根据Degree值排序，网络中最重要的5个节点分别为IL-6、TNF、PTGS2、MMP9与NOS3等。

图7 预测靶点的PPI 网络Fig 7 PPI network of the predicted targets

IL-6、TNF、PTGS2与MMP9基因编码产生蛋白均为可作为炎性标志物，提示炎症水平。NOS3基因编码产生蛋白是内皮型一氧化氮合酶（eNOS），可以调节血管张力和局部血流，抑制VSMCs细胞增殖以及调节白细胞-内皮相互作用等多种作用[13]；精氨酸在eNOS催化下合成NO，NO具有多种抗AS作用，包括抑制低密度脂蛋白氧化、防止白细胞黏附血管内皮，抑制血管平滑肌细胞增殖等[14]；并且NO还被认为是一种抗炎分子，其抗炎作用主要是通过抑制NF-κB 活性来抑制AS的形成[15]。根据综合评分，在以NOS3为中心的PPI网络中与NOS3节点关联强度最高的节点为ESR1，编码产生蛋白是雌激素受体α（ERα）（见图8）。为了验证四物汤对VSMCs更广泛的抗AS作用，后续验证实验对四物汤处理的VSMCs进行NO水平检测，并采用Western blot法对VSMCs的eNOS与ERα表达量进行检测。

图8 以NOS3为中心的PPI网络Fig 8 A NOS3-centric PPI network

2.2 体外实验结果

2.2.1 VSMCs生长形态与表型的鉴定 光学显微镜下观察显示，VSMCs形状为梭形，平行排列，细胞生长呈“谷峰状”（见图9）。免疫荧光实验染色显示，TRITC标记的α-SMA呈红色，胞质内存在大量平行于细胞长轴的红色细丝（见图10），表明该细胞具有VSMCs的表型特征。

图9 光学显微镜下VSMCs形态与分布（20×）Fig 9 Morphology and distribution of VSMCs under light microscope（20×）

图10 α-SMA免疫荧光染色（100×）Fig 10 α-SMA immunofluorescence staining（100×）

2.2.2 四物汤冻干粉对VSMCs增殖能力的影响通过CCK8法测试了不同质量浓度的四物汤（25～1500 μg·mL－1）对VSMCs活力的影响，如图11所示，四物汤作用24 h后，对细胞增殖率无明显影响，推测在这一质量浓度范围内四物汤的处理对VSMCs生长无细胞毒性，故本实验挑选其中具有一定质量浓度差的高、中、低3个剂量（分别为1000、500、100 μg·mL－1）进行后续实验。

图11 四物汤对VSMCs增殖率影响（±s，n＝3）Fig 11 Effect of different concentrations of Siwu decoction on VSMCs proliferation rate（±s，n＝3）

2.2.3 四物汤冻干粉对ox-LDL诱导VSMCs增殖能力的影响 如图12 所示，与空白对照组相比，模型组VSMCs的增殖率显著提高（P＜0.01）；与模型组相比，四物汤组细胞增殖率均降低（P＜0.05），对ox-LDL诱导的增殖有一定抑制作用，但三组间差异无统计学意义。

图12 四物汤对ox-LDL诱导的VSMCs增殖率的影响（x± s，n＝3）Fig 12 Effect of different concentrations of Siwu decoction on ox-LDLinduced VSMCs proliferation rate（x ±s，n＝3）

2.2.4 四物汤冻干粉对ox-LDL诱导VSMCs的NO水平的影响 如图13所示，与空白对照组相比，ox-LDL处理的VSMCs的NO产生水平下降（P＜0.05），而高剂量与中剂量的四物汤处理VSMCs，均可明显提升ox-LDL诱导的NO水平的下降（P＜0.01），并且呈现一定的浓度依赖性。

图13 四物汤对ox-LDL诱导的VSMCs中NO水平的影响（±s，n＝3）Fig 13 Effect of Siwu decoction on nitric oxide levels in ox-LDLinduced VSMCs（x ±s，n＝3）

2.2.5 四物汤冻干粉对ox-LDL诱导VSMCs的eNOS与ERα蛋白表达的影响 根据网络药理学分析结果，为了进一步验证四物汤对VSMCs作用的具体分子机制，通过Western blot法观察四物汤对eNOS和ERα在VSMCs中表达量的影响。如图14所示，与对照组相比，ox-LDL可以明显降低ERα、eNOS的表达量（P＜0.05），这一作用在加入四物汤的处理后被逆转，并且均在四物汤剂量为500 μg·mL－1组效果最为明显。

图14 Western blot法检测VSMCs的ERα、eNOS的表达水平（±s，n＝3）Fig 14 Expression level of ERα and eNOS analyzed by Western blot（±s，n＝3）

3 讨论

药用植物抗AS活性主要表现为抗炎、抗氧化、降压、降脂、抗血栓等多种作用。此外，大多数药用植物的特点是其多效抗AS作用。此外，药用植物衍生的化合物具有相对安全、副作用少的特点，因此可作为抗AS的一类有效药物[16]。本研究也证实了四物汤的主要活性化合物具有此类作用。

3.1 四物汤防治AS可能涉及的主要活性化合物

通过TCMSP和GEO数据库获得四物汤干预AS的37个靶点，靶点对应的四物汤中主要活性化合物按重要程度排序为：山柰酚、儿茶酸、杨梅酮、川芎哚、β-谷甾醇、豆甾醇。其中山柰酚是一种天然类黄酮，其抗炎、抗氧化和抗肿瘤的功效已被报道用于治疗多种疾病[17]；在血管内皮细胞中，还可激活血红素氧合酶1（HO-1）的表达，激活过氧化氢酶 （CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽 （GSH-Px）等，保护血管免受氧化应激和炎症诱导的损伤[18]。儿茶素是常见于茶类中的一种黄酮类化合物，其摄入量与减少心血管疾病成正相关[19-21]；儿茶素可激活eNOS酶产生NO，以改善血管内皮功能障碍[22-23]；并且儿茶素可通过抑制基质金属蛋白酶-2的表达，抑制凝血酶诱导的VSMCs的增殖[24]。杨梅酮具有良好的抗氧化及抗肿瘤等活性[25-27]，并且对氧化应激诱导的血管内皮细胞凋亡有保护作用[28]。川芎哚是中药川芎、党参中的活性物质之一，川芎哚及其类似物具有一定程度的抗凝血、减少红细胞聚集、抗血栓与改善血液流变学的作用[29-31]。β-谷甾醇存在于多种中药的甾体类化合物，富含β-谷甾醇的药物在巨噬细胞中通过影响NO与活性氧（ROS）明显减少小鼠的主动脉根部AS病变面积，并且阻止人单核细胞THP-1与VSMCs的黏附[32]。

3.2 四物汤防治AS预测靶点的富集分析

对四物汤防治AS的靶点进行GO富集分析发现，主要参与的BP为对炎症反应、缺氧反应、血压调节、雌激素反应、细胞因子分泌的正调控。众多临床与基础实验都已经证实AS是一种慢性血管炎症反应，而近年来的研究也进一步证实机体免疫细胞的反应是AS斑块形成的第一步，更是动脉粥样斑块不稳定的主要原因之一[33]；高血压作为AS的重要风险因素，血压升高状态下对内皮细胞损伤与促进VSMCs过度增殖在形成AS的过程中也是必不可少的[34]；KEGG富集分析得到TNF、NF-κB、NAFLD、乙型肝炎、癌症转录调控失调等信号通路。对于AS进展过程中分泌的众多细胞因子的调节，也对AS的治疗有非常重要的意义。细胞因子都是通过其所在信号通路来发挥作用[35]，其中TNF-α是最重要的促炎症因子之一，可以诱导ROS的产生，使内皮功能出现障碍，并转换VSMCs的细胞表型[36]；同样在一个炎性因子主导的通路中，NF-κB参与激活内皮细胞黏附分子如E-选择素、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）等与单核细胞的黏附作用，并且转换VSMCs表型，同时巨噬细胞的黏附增多，促进AS斑块的发生[37]。

3.3 四物汤防治AS预测靶点的PPI网络

在PPI网络中，根据Degree值排序最重要的5个节点分别为IL-6、TNF、PTGS2、MMP9与NOS3等。除IL-6、TNF、PTGS2与MMP9均可编码产生炎性标志物分子外；NOS3基因编码产生的eNOS分子不仅有调节血管张力和局部血流等作用，其催化产生的NO可通过诱导和稳定NF-κB的抑制因子IκB而抑制 NF-κB的激活，从而控制黏附分子与炎症介质的表达，对AS的病理发展起到抑制作用[38]。根据对蛋白互作强度的综合评分（由基因融合、共表达与大规模实验的支持等因素综合计算），在以NOS3为中心的PPI网络中与NOS3节点关联强度最高的节点为ESR1（编码产生ERα）；雌激素可以一种ERα依赖的方式快速激活MAPK通路，进而激活eNOS；并且雌激素与雌激素受体（ERs）结合，通过刺激热休克蛋白90（HSP90）和AKT/蛋白激酶B（PKB）依赖的机制激活eNOS[39]。

3.4 四物汤对ox-LDL诱导的VSMCs细胞的作用

在动物模型和人类研究中，VSMCs的增殖导致血管内膜和动脉中层斑块的生长，过度的VSMCs增殖已被证明在AS发生过程中非常重要[40]。CCK8实验发现四物汤对未经处理的VSMCs增殖无明显作用，但是在经过ox-LDL处理后，四物汤可抑制诱导后的VSMCs过度增殖，对AS的防治产生积极作用。四物汤可明显提高经ox-LDL诱导的VSMCs的NO水平，而四物汤对VSMCs增殖的抑制作用可能通过对NO水平的调节来发挥。eNOS具有抗AS的作用，eNOS表达量的升高也提示了四物汤对防治AS的积极作用；课题组前期研究提示四物汤在多个维度显示出了雌激素样作用；研究显示，雌激素和类雌激素化合物除了对eNOS作用的长期影响外，还存在对NO生物利用度的短期影响，雌激素可能通过经典雌激素核受体介导以调节eNOS的表达[41]；关于四物汤是否发挥雌激素样作用调节eNOS水平，需要进一步的实验探究。由于雌激素对心血管系统具有保护作用，雌激素替代疗法已经作为临床上防治女性绝经后AS的一种方案，但是由于其伴随着妇科肿瘤发病风险的提高而一直备受争议；本研究结果提示四物汤可能作为一种雌激素样药物对AS进行防治，为药物的临床应用提供了部分实验依据。